Uso degli animali nella ricerca biomedica
Si usano nella ricerca esploratoria e terapeutica
-disease indotto sperimentalmente: animale ha una patologia che mima quella umana e questa patologia non esiste normalemente nell’animale, gli è stata indotta
Per via chirurgica
Manipolazione genetica
Farmacologica
Comportamentale
-disease spontaneo: nell’animale si produce spontaneamente una patologia che è simile a quella umana
(es gatto può soffrire di asma, cani con defici di fattore VIII della coagulazione -> emofilia A)
-negativo: l’animale rappresenta il controllo negativo della sperimentazione, per es una malattia che si sviluppa nell’uomo e non nell’animale
(es cani non sviluppano aterosclerosi, alcuni primati infettati con HIV non sviluppano AIDS)
Informazioni (readout)
-comportamentale: scoprire che nel modello animale questo non sente per es piu dolore, disturbi apprendimento menìmoria o capacità motoria
-biochimico: preparare tessuti, isolare mRNA, analizzare proteine
-analisi molecolari: tecniche omiche (analisi trascrittoma), genomica, metabolomica
-osservazioni istologiche: prelevare il tessuto infetto
Più del 90% delle specie animali usate in sperimentazioni sono ratti e topi.
Ratto: peso 50-200g
Gestazione 21 gg
N figli: 4-20
Vita 3 anni
Topi: peso 20-30 g
Gestazione 19 gg
N figli: 1-12
Vita 2 anni
Queste caratteristiche permettono una ricerca mirata, veloce, efficace e mirata
Sono esperimenti molto costosi
Il topo è il 61%
Ratto 14%
Porcellino d’india 2%
Talvolta maiale, rarissimamente cane (per studi respiratori)
Motivi:
-studi biologici di base (capire perché o come funziona qualcosa)
-diagnosi e malattie
-tossicologia
-produzione e controllo qualità per medicina umana e veterinaria
-ricerca e sviluppo F
Bisogna conoscere tutti di questi animali se si vogliono usare
Come si comportano, la loro fisiologia, la riproduzione, patofisiologia
Per es i roditori non vomitano, per il vomito si usa il furetto
Bisogna saperne anche i limiti, alcuni ceppi ci vedono poco (albini), altri sentono poco, attività metabolica del P450 (perché topo ha pochissimi di questi enzimi)
Si puo anche studiare il destino di un F in questi animali
Somministrazione:
Orale, endovenosa, intramuscolare, sottocutanea, intraperitoneale, intratecale o intracerebroventricolare
Obiettivo: riprodurre nell’animale una malattia umana dobbiamo desiderare tre cose:
Face validity: vorremmo avere che gli stessi sintomi, manifestazioni e segni della patologia nell’uomo siano anche presenti nel topo o nel ratto (somiglianze fenomenologiche). Difficile!
Predictive validity: usare il modello migliore possibile e essere certi che nel modello funzionano gli stessi F che funzionano anche nella malattia umana
Construct validity: considero il modello utile perché la causa nella malattia nell’uomo sia la stessa nella malattia del topo
Raramente sono tutte e tre presenti, hanno a che fare con la avlidità del modello (cioè quanrto mima la patologia umana)
Esempi per capire l’importanza di questi livelli
Es: modelli di ansia
Si prende un topolino maschio (per non avere effetti degli ormoni) e si sfrutta il comportamento naturale del topo: ha paura ma è motivato dalla ricerca di cibo e accoppiamento.
Elevated plus maze (arena rettangolare con due braccia incrociate, messe a croce ed è sopraelevato da terra)
Il topolino tende a mettersi nei due bracci chiusi, si puo vedere nell’arco di un certo tempo quanto tempo l’animale ha opassato nelle braccia aperte, quanto in quelle chiuse e quanto è entrato e uscito.
Se un animale è tranquillo passa gran parte del tenop nelle braccia chiuso ma anche nelle braccia aperte, se è ansioso sia farmacologicamente che geneticamente sta praticamente solo nei bracci chiusi.
Se al topo ansioso do una benzodiazepina passa piu tempo anche nel braccio aperto.
Non è un modello che ha face e construct validity
Ma è un modello predittivo per la risposta ai F ansiolitici (predictive validity)
Es modello di depressione
Per creare stress entro ogni giorno nella gabbia del topolino a orari random e sposto la gabbia, metto un altro maschio nella gabbia, lo metto a contatto con l’odore si un suo predatore, cambio il ritmo della luce.
Dandogli questi stress in modo imprevedibile il topo manifesta problemi di comportamento, perde il piacere per le cose piacevoli, diventa anedonico.
Altro modello in cui si studia il comportamento simil-depressivo è il test del nuoto forzato (forced swimming test)
Il topo sano non stressano in un cilindro con acqua nuota un po’ ma poi si stufa e tenta di uscire e arrampicarsi sul vetro, per la maggior parte del tempo tenta di uscire.
La stessa cosa con un topolino stressato o con topi geneticamente stressati, perdono motivazione a scappare da una situaizone così. Addirittura potrebbe smettere di nuotare e affoga. C’è una disperazione comportamentale (pensa non ci sia via di uscita).
È un modello sensibile ai comuni antidepressivi, anche se i motivi di depressione e le conseguenze sono diverse.
I modelli animali di depressione sono ritenuti poco predittivi
Altro esempio: modelli di drug of abuse/drug dependence
Meccanismi della dipendenza psichica: si conoscono abbastanza bene le aree implicate nella dipendenza psichica una è la vta nucleo accubens. Le vie implicate nella dipendenza sno le vie dopaminergiche.è importante a via mesolindocorticale che ha nella VTA e nel nucleo accubes le stazioni principali. Tutti i F d’abuso lavorano sul sistema dopaminergico,. Stiamo modulando il rilascio di dopamina. Quando la sinapsi è rilasciata. Amaggor parte dei farmaci d’abuso : cocaina interferisce con le vie dopaminergiche perché blocca il trasportatore della dopamin. Quando abbiamo la trasmissione dopaminergica c’èun mggior tono della sinapsi. Anche le anfetamine possono essere ricondotte a questo meccanismo è più complicato perché nn bloccano il trasportatore ma lo modificano e lo fanno funzionare in maniera inversa, fanno cioè rilasciare dopamina. Le dopamine agiscono anche interferendo con il metabolismo della dopamina.le anfetamine agiscono anche su altri neurotrasmettitori.
La dipendenza psichica è quella condizione per cui una persona tossicodipendente cerca la droga pur sapendo che è deleteria per la salute. la dipendenza da farmaci è il risultato . un meccanismo è il rinforzo positivo, la maggiorparte dei f per i quali si può diventare dipendenti hanno la capacità di continuare a provocare il desiderio del farmaco . l’individuo continua a cercare il farmaco. Un’altra cosa è il rinforzo negativo è Di molti farmaci, la maggiorparte….., nell’organismo sono avvenuti dei cambiameti e quando si interrompe il f la persona sta male perché patisce l’assenza di F.
Ci sono altre caratteristiche, danno uno stimolo di tipo discriminativo, la ricerca si associa ai comortamenti,ai luogh a cui si è somministrato il farmaco. Le persone che hanno dipendenza se qualcosa nel contesto glielo ricordo. La maggiorparte di queste cose s vedono anche nei modelli animali.
È possibile dopo continua esposizione ad un farmaco d’abuso fare imparare, che in n certo ambiente ha ricevuto una gratificazione, è possibile fare imparare che in determinate condizioni che , quando ha imparato è in grado di autosomministrarsi il farmaco, a un certo punto lo fa in modo molto frequente. Un animale che diventa dipendente continua a ricercare il farmaco anche al costo d premere una leva che nn è un comportamento assimilabile ad un roditore .
Se noi mettiamo un roditore in una scatola e lo mettiamo in una scatola metà bianca e metà nera,mettiamo l’animale nella parte scura e mettiamo il f nella parte chiara e gli diamo un farmaco d’abuso, quando viene messo nella parte bianca si comporterà in modo da ricercare in continuazione il f-> conditional play preference.
La alidità di questi modelli per l’abuso è maggiore qui rispetto ad altri modelli, c’è una sufficiente construct validity( la causa che ha scatenato la malattia è la stessa nell’uomo e nell’animale) i meccanismi che inducno alla dipenza sono gli stessi nell’uomo e nel topo , c’è una elevata face validity ( dimostrabili anche nell’uomo)
Molti modelli di malattie umane che si cercano di trasferire all’animale idealmente dovrebbero avere la stessa causa, la fenomenologia dovrebbe essere la stessa , è importante anzi essenziale che l’animale risponde al farmaco come l’uomo
Gli animali a volte si usano anche per la SAFETY PHARMACOLOGY: si usano molto i roditori almeno due specie diverse. È l’insieme di tutti quegli studi in cui uno ha un candidato e vuole essere sicuro che quando arrivasse all’uomo non avesse delle conseguenze importante sulla fisiologia dell’uomo
Sul sistema cardiovascolare: aumenterebbe press arteriosa, o ritmo cardiaco, o come agiscono sul canale herg.
Ci sono modi per fare elettrocardiogramma nel topo
Bisogna guardare anche la funzionalità respiratoria, usiamo animali consci o no. Ci sono anche delle valutazioni generali di cosa produce a livello neurologico, si possono guardare i comportamenti.
È possibile misurare nei roditori se sono in grado di imparare dei compiti in condizioni particolari, se ricordano e per quanto tempo lo ricordano .
Una delle cose che si fa per misurare la memora e l’apprendimento può fare il test di Morris.
È talmente validato da essere usato in tutto il mondo , è un test in cui conta tantissimo il fatto che sia intatta e funzionante l’ippocampo. Fanno parte della sfera cognitiva.
Il test di Morris valuta la capacità di apprendere le cose relative allo spazio.
Si usa un’arena in cui c’è dell’acqua, ha delle dimensioni standard, ha dimensioni commesurate a chi deve utilizzare lo spazio, l’acqua deve essere a temperature confortevoli. Topi e ratti sanno nuotare bene anche se malvolentieri, l’altezza dell’acqua è ben definita. L’uomo ha dei punti di riferimento per orientarsi e anche il topo. Ci sono dei punti di riferimento per il topo nella stanza che possono essere anche dei cartelli colorate e li lasciamo cosi i cartelli. L’animale viene messo nell’acqua e c’è una piattaforma che un cm sopra al livello dell’acqua. Lui nuota e vedere la piattaforma è un punto per smettere d nuotare. Lui sa che ha un punto per riposarsi e lo impara. Poi facciamo diventare l’acqua bianca e non vede il fondo e abbassiamo piattaforma a livello dell’acqua, non vede la piattaforma e gira e a un certo punto sale. Siccome ci sono dei punti di riferimento, la prima volta cronometri e vedi quanto tempo ci ha messo a trovare la piattaforma. Il secondo giorno a trovare la piattaforma ci metterà sempre meno perché ha imparato, questo è un apprendimento legato allo spazio. -> training trials
Poi il tempo scende gradualmente fino a un plateau non scende oltre quel tempo. Dopo che ha imparato lo rimettiamo nella stessa situazione , gli togliamo la piattaforma. Osserviamo se lui cerca la piattaforma proprio in quel punto. ->Probe trial misuriamo quando tempo sta nel quadrante in ci c’è la piattaforma , se l’animale è malato a distanza di tempo non ricorderà il quadrante e quindi sarà casuale un tempo in cui è stato in quadrante piuttosto che un altro.
Sono capace di imparare un compito spaziale.si po’ utilizzare per dimostrare la correlazione tra perdita di memoria e radiazioni. Se si irradia il cervello con radioterapia x tumore al cervello ad esempio si fa fatica a ricordare (è frequente che ci faccia radioterapia non ricordi).
Gli animali giovani passano molto tempo nel quadrante dove c’era la piattaforma in animali ricordano meno.
Apprendimento in animali giovani che hanno fatto esercizio fisico migliorano la performance ma anche gli anziani. Bisogna fare molti test
Object recognition test-> riconoscimento di oggetti.
Se mettiamo il topo in ambiente diverso il topo familiarizza anche con gli oggetti se a distanza di tempo.
Una cosa molto utile da studiare è l’attività locomotoria, si mette in moto per capire dov’è, si misura attività locomotori una volta che ha capito dov’è si ferma, se ci sono animali con disturbi del movimento o neurologici non si mettono in movimento o non riescono a stare in verticale.
Oppure si mette il topolino sul rotarod una ruotache viene messa inmviemnto il topo se nn ha problemi riesce a usare in equilibrio se ha problemi invece cade.
Bisogna sapere che relazione c’è tra malattia animale e umana. Malattia genetica in cui c’è o mutazione in un gene, l’idea è quella di sapere la proteina modificata nella sua attività perché malfunzionante o assente. Una delle cose è creare un animale che ha una mutazione nel gene e poi studiare il fenotipo nel modello animale, uno dei modi più facile è creare degli animali transgenici, il ratto è più difficile da mutagenizzare. Il patrimonio genetico è pe il 95 % uguale. L’idea è quella di usare topi transgenici per studiare problemi umani. All’interno del patrimonio genetico è stato inserito un frammento di un gene umano.
ESEMPI
in cui animali geneticamente modificati sono stati utili per capire una malattia es funzione dell’ormone della crescita: differenza di dimensione tra topolino normale e topolino a cui è stato dato ormne della crescita.
È stato scoperto che se si fa esprimere un gene mutato nei topolini sviluppano epilessia e tendono a morire, è stata stabilita la correlazione tra un gene mutato ed epilessia
Overespressione di un gene mutato nell’alzheimer: over espressione della proteina precursore dell’amiloide (APP) mutata: modello di malattia di alzheimer. C’è una forma sporadica e una forma familiare: in questi casi l’alzheimer compaiono a 30 anni. Uno dei geni proteina precursore dell’amiloide app, ci sono una trentina di mutazioni diverse associati ad alzheimer, ci sono tantissimi topi in cui sono stati creati animali transgenici che esprimono geni , nel tempo il tessuto cerebrale si infarcisce di proteine che si , betaamiloide si accumula nel cervello e distrugge le sinapsi, comincia dall’ippocampo. Questo modello assomiglia all’alzheimer, se facciamo il water test perdono memoria i topolini. Molti F che sono in grado di prevenire questo hanno fallito oppure hanno dato tra effetti collaterali. I modelli non avevano predicty valibility. Si è sbagliato a pensare che fosse così importante la mutazione del gene.
Un gruppo ha studiato come si sviluppa la corteccia umana rispetto a quella del macaco di un topolino etc. volevano cercare quei geni della razza umana che sono in grado di produrre le differenze del genere umano. Hanno fatto la differenze tra i vari trascrittomi. Ci sono tantissimi geni in comuni, ma che in quella umana ci sono 56 geni che sono solo nell’uomo e tra questi solo uno era interessante:ARHGAP ( espresso nella corteccia umana), se lo si fa esprimere nel topo la corteccia del topo inizia ad avere delle circonvoluzioni . questa proteina è il frutto di una duplicazione di un gene durante l’evoluzione la duplicazione, si scopre che gli scimpanzè, si pensa che la proteina prodotta da un gene non ha la stessa funzione dell’altra
Gene targeting: abolire un gene. Si può fare inattivazone di un genere che si chiama knock out e serve per studiare la funzione di un gene. Knock in si sostituisce un gene per un gene che porta la mutazione-> topini che avevano un gene umano per la sub alfa per il recettore delle benzodiazepine in cui era stata formata la forma che non era più in grado di legare le benzodiazepine
Topolini knock per p50 (nfkb)sembrano normali, sembra che abbiano lo stesso cervello ma in assena di p50 nn riescono a rispondere ad antigeni ma questi topolini hanno una riduzione fortissima nella neuogenesi nell’ippocampo, hanno un disturbo nella formazione di nuovi neuroni, se noi facciamo il water maze nteremmo che loro ricordano la poszione della piattaforma ma che se facciamo un maze diverso fatto a Y e gli chiudiamo un braccio del maze, se noi mettiamo la parte aperta, un topolino normale preferirebbe stare nel braccio nuovo, se facciamo la stessa cosa nei tpolini che nn hanno p50 ( i tpoi normali fino a 30-50 min si ricordno i knock out si dimenticano dopo 20 min, hanno un difetto selettivo nella memori a breve termine ed è importante perché la memora a breve termine è quella che scompare prima nell’alzheimer,l’assenza di p50 è molto importante per la memoria p50)
Non produrre neuoni ha a che fare con memoria a breve termine più che a lungo termine
Esempi di errori
Topo a cui manca CamKII chinasi che ha a che fare con l’apprendimento. Quelli che non hanno quella chinasi non sanno apprendere proprio, questi topolini non imparano nel water maze ma loro sono talmente ansiosi che non si muovono
Esempio2 si voleva dimostrare che mglur8 avesse un ruolo nell’ansia, topi con problemi messi nella box light and dark (buia e luce), la conclusione avrebbe potuto essere che gli animali sono ansiosi xk stavano nella parte buia e basta mentre i wildtype andavano d entrambe le parti, ma è venuto fuori che era stato usato un ceppo di topi che ha una degenerazione della retina quindi sono quasi ciechi e pretendere che riconoscano la parte scura o chiara era assurdo