La matrice extracellulare e molecole di adesione.
I ligandi per le molecole di adesione si trovano nella matrice extracellulare. La MEC è costituita da diversi tipi di glicoproteine, proteoglicani (glicoproteine differiscono dai proteoglicani per la composizione amminoacidica), hanno la funzione di apportare acqua alla matrice, per ammortizzare le sollecitazioni meccaniche, e da acido ialuronico. Nella maggior parte degli animali il componente più abbondante nella MEC è il collagene, che dà resistenza e adattamento. La MEC contiene altri componenti: proteine come la fibrina, l'elastina, la fibronectina, la laminina deve formare delle giunzioni interagendo con il collagene, la membrana basale ricca di un sottotipo di laminine, la funzione della membrana basale è quella di mettere in comunicazione l'epitelio con il sottostante derma, e l'entactina; inoltre minerali come l'idrossilapatite, nel tessuto osseo, e fluidi come plasma e siero con antigeni liberi. In aggiunta la MEC funge da deposito di diversi fattori di crescita cellulari.
Cambiamenti nella condizione fisiologica possono innescare l'attività di proteasi che provocano il rilascio locale di questi depositi. Questo permette una rapida attivazione delle funzioni dellulari nella zona di rilascio, senza dover sintetizzare ex novo i fattori. A seconda della sua composizione la MEC può svolgere differenti funzioni come ad esempio quello di supporto delle cellule e del loro ancoraggio e di divisione tra i diversi tessuti. L'ancoraggio delle cellule avviene attraverso interazioni tra la MEC e proteine di membrana, dette glicorecettori, appartenenti alla famiglia delle integrine. Attraverso questi “ponti” molecolari le variazioni della MEC possono trasmettere stimolazioni meccanische ed influire sull'organizzazione del citoscheletro; allo stesso modo il citoscheletro può indurre modificazioni nella MEC. Spesso la MEC ha un ruolo nel processo di regolazione riconoscimento intercellulare, permettendo il corretto funzionamento di recettori cellulari come le caderine e le molecole adesive dei neuroni (N-CAM).
Sono 3 le componenti principali dell'EMC:
• collagene insolubile: impalcatura, fornisce forza e resistenza al tessuto/organo
• proteoglicani: ammortizzatori molecolari
• proteine della matrice adesiva: interagiscono con le molecole di adesione (CAM) presenti sulle membrane cellulari
Assemblate in diverse combinazioni garantiscono specificità d'azione e differenziamento alle cellule del tessuto che la compongono. Interazioni tra EMC e CAMs innescano segnali on/off all'interno delle cellule.
EMC serve anche a fissare sequestrare fattori di crescita.
Il collagene è sintetizzato intracellularmente da fibroblasti sotto forma di protofibrille, viene assemblato a tripla elica (protocollagene), viene inserito in vescicole per esocitosi, viene assemblato a collagene molecolare, poi a fibrille e infine a fibre (0,5-3 μm).
La laminina è una proteina costituita da 3 subunità, è importante perché si interseca con il collagene per formare un'impalcatura tridimensionale e ponti trasversali, più laminina c'è più fitta è la rete.
I proteoglicani riempiono l'impalcatura di collagene richiamando acqua dai vari tessuti, per ammortizzare le sollecitazioni meccaniche.
La membrana basale è la zona di separazione tra epitelio e derma, è costituita da EMC specificatamente differenziata.
Molecole di adesione:
• caderine
• integrine
• selectine
• Ig-like
Sono 3 meccanismi tramite i quali le molecole di adesione garantiscono le interazioni cellulari:
• omofilico
• eterofilico
• legame mediato
Le molecola di adesione tendono a formare dei cluster, si raggruppano in cis sulla membrana cellulare (tendono a fare delle interazioni sulla membrana nella stessa cellula, trans cellule diverse), sono collegate al citoscheletro, e molto spesso sono glicosilate.
Caderine:
mediano interazioni di tipo omofilico: interazioni cellula-cellula:
• famiglia di calcium-depende CAMs
• principali responsabili della cell-cell adesion (omofilica)
• 40 tipi diversi e.g. e o epithelial cadherin o N o neuronal cadheerin
Le caderine sono importanti perché ogni cellula ha una particolare sequenza di caderine che può essere riconosciuta, una forma di controllo:
• proteine con singolo dominio TM, di 700-750 amminoacidi
• presentano domini detti folder cadherin repeats
• formano dimeri ed oligodimeri
• presentano Ca binding domains
• interazioni attivate dal Ca in modo proggressivo
la contrazione di calcio extracellulare è di 2-5 mM, questo permette la formazione di oligodimeri di caderina.
Giunzioni aderenti e desmosomi.
I tessuti sono caratterizzati da adesioni specializzate basate sulle caderine:
• giunzioni aderenti (versante latero-laterale): cintura continua di caderine presenti negli epiteli; interconnessa con la porzione actinica del citoscheletro
• desmosomi (intracellulare): presenti in gran numero negli epiteli; connessione tra le placche proteiche che si formano al di sotto della membrana ed i filamenti intermedi del citoscheletro
Emodesmosomi: si creano nella zona di adesione tra la parte basale della cellula epiteliale e la membrana basale, singolo aggregamento citoscheletrico mediante integrine.
Ruolo delle caderine nello sviluppo embrionale:
• allo steto di blastula vengono definiti 3 foglietti embrionali sulla base del riconoscimento tra caderine, ectoderma, mesoderma ed endoderma, queste 3 tipologie di cellule sono caratterizzate da 3 diversi tipi di caderine. I 3 foglietti embrionali devono poi formare durante lo sviluppo embrionale tutti i vari tessuti e organi;
• il coordinamento dei meccanismi di migration e sorting è garantita dalle caderine, questo processo viene regolato dall'espressione di determinate caderine e al momento giusto.
Adesione cell-cell selettiva:
• se dissociate cellula embrionali di organi diversi si riassemblano in modo tessuto-specifico, ciò garantito da un corretto riconoscimento cellula-cellula mediato dalle caderine;
• nei tessuti embrionali si riconoscono: e-caderine (epitelio), n-caderine (nervi e muscoli), p-caderine (placenta e epidermide);
• la blastula usa le caderine per raggruppare (sorting) le cellule di ciascun foglietto;
• se l'espressione delle caderine è bloccata la blastula non si forma Inizialmente si differenziano solo un numero limitato di cellule, che prendono il ruolo di caderine, questo processo attiva una serie di risposte cellulari, che attivano e alimentano un processo di differenziazione cellulare, e la produzione di fattori diffusibili, i quali inducono le cellule che raggiungono a esporre le caderine dello stesso tipo. Sui diffonde quindi un segnale trasversale differenziatico, ciò avviene a livello epiteliale e nervoso.
Il sistema nervoso si forma dalla noto corda: tubulo di cellule endodermiche che si differenzieranno a formare la colonna vertebrale, i muscoli spinali, il cervello e il midollo spinale. Le caderine sono in grado di formare una serie di risposte cellulari che hanno un ruolo importante per l'adesione, sono essenziali per la formazione delle giunzioni di adesione e di altre connessioni, sono importanti per la motilità cellulare, la migrazione e la differenziazione (sviluppo embrionale), importante anche per le interazioni con il citoscheletro, inoltre collaborano con i segnali trofici innescati dai fattori di crescita (essi non mediano solo la proliferazione cellulare, ma inducono anche programmi differenziatici, e nelle caderine mediano soprattutto queste interazioni), infine influiscono anche sulla trasmissione genica, alcuni segnali partono dalla membrana e arrivano al nucleo, la risposta può sia attivare che inibire. Le caderine di cellule vicine possono subire un processo di inibizione da contatto, le e-caderine delle cellule epiteliali una volta che creano le giunzioni di aderenza mandano un segnale di blocco della proliferazione, per evitare una sovrapposizione di cellule.
Dialogo caderine nucleo-membrana: quando avviene un'interazione viene sequestrata sulla struttura intracellulare la beta-catenina, essa viene poi eliminata, quindi le sue concentrazioni sono basse (avviene il meccanismo dell'inibizione da contatto), se l'interazione non avviene, la beta-catenina non può essere sequestrata e degradata, quindi migra nel nucleo e induce la sintesi di proteine con funzione proliferatica, e vengono prodotti fattori diffusibili che aumentano ancor più la proliferazione. La sostituzione delle caderine con n-caderine può essere responsabile dell'evoluzione di cellule tumorali, l'eccessiva presenza di beta-catenine innesca segnali convergenti e sinergici che degradano le caderine e producono n-caderine, ciò provoca la sovrapposizione e sovraproliferazione di cellule e formazione di nuovi vasi, che portano poi alla diffusione delle metastasi.
E-cadherin loss/down regulation:
1. Mutazioni E-caderine: carcinoma gastrico e della mammella loblare
2. Down regulation post-trascrizionale: Hakai, p120-dependency
3. Metilazione del promotore: CpG Island
4. Repressione trascrizionale: membrane recetors (wnt, Nthc: SLUG/SNAIL Axis)
5. repressione traduzionale: Myc
MiRNA Axis: i micro RNA sono delle sequenze complementari e antiparallele per mRNa classici, essi una volta sintetizzati si appaiano con i rispettivi mRNa e ne inducono la sua degradazione. È un sistema di controllo post-traduzionale.
Integrine: possono formare particolari tipi di giunzioni aderenti che si trovano sul versante basale della cellula epiteliale (e non intracellulare latero-laterale delle caderine). Le integrine mediano le interazioni cellula-EMC (con componenti della matrice, del plasma e con il citoscheletro).
Le placche di integrine sono dette emidesmosomi.
Le integrine possono formare anche le adesioni focali, sempre tra membrana basale e matrice, sono molto dinamiche, si assemblano e disassemblano molto velocemente, questo processo è alla base della motilità cellulare.
Integrine:
interazioni tra cellula e EMC:
• interconnettono la EMC con il citoscheletro
• sanno mediare anche interazioni cellula-cellula deboli e transitorie
• dimero di subunità alfa e beta: 17 tipi alfa e 8 tipi beta-caderi complessi alfa-beta fanno da recettori per specifiche componenti della matrice, co-recettori di membrana su cellule adiacenti, fattori plasmatici (alfa1beta1 collagene e laminina, alfa5beta1 fibronctina)
• le cellule possono esprimere più tipi di integrine
• l'adesione è regolata a più livelli, il primo è quello dell'espressione (quanti dimeri di integrina sono presenti in membrana up regulation, o down regulation se avviene internalizzazione), poi sono regolate da Mg e Mb positivamente e dal Ca che può avere a seconda delle concentrazioni un'attività stimolante o inibitoria.
Le integrine costituiscono specifiche giunzioni dette:
• adesioni focali: sono transitorie, complesso di 2 e più proteine, possono aumentare o diminuire in base allo stress fisico o alla motilità
• giunzioni di aderenza ed emidesmosomi: stabili filamenti intermeti/collagene e laminina negli epiteliale
Le integrine sono necessarie per il controllo positivo sul movimento cellulare, legato a una modulazione dinamica nel tempo dei complessi di adesione, si distruggono vecchie adesioni focali e se ne creano di nuove. Sono importanti anche per la sopravvivenza cellulare, attivano chinasi e fosfatasi, e innescano dei segnali. Le integrine dipendono da cationi bivalenti per l'interazione col ligando. Si assemblano utilizzando diversi sottotipi di subunità alfa e beta e questo comporta la varietà dei ligandi che possono essere reclutati. Eventi cellulari in cui sono coinvolte le integrine: controllo strutturale, controllo della motilità cellulare, sopravvivenza, trascrizione genica e proliferazione. Le integrine non sono semplicemente proteine svincolate dal resto ma sul versante extracellulare prendono rapporti con i rispettivi ligandi e sul versante intracellulare prendono rapporti con tutta una serie di proteine che consentono di trasdurre una serie di segnali che promuovono gli eventi prima descritti. Alcune proteine (citoesina-1, beta-endonexina e rack1) sono molto importanti per determinare uno step fondamentale di attivazione dell'integrina.
Le integrine si possono trovare in due stati conformazionali: uno inattivo, tipiegato su se stesso, e uno attivo, esteso.
In questa maniera il sito di interazione col ligando è disponibile all'interazione e si può verificare l'innesco dei segnali intracellulari. Si tratta di un recettore che non è pronto all'interazione col ligando ma deve essere preattivato. Esiste uno step nell'attivazione, il cosiddetto In-Out Signaling.
La modulazione del segnale dipende dall'arrangiamento del complesso alfa-beta. Le integrine si possono trovare in cluster in forma inattiva e l'In-Out signaling determina la transizione del complesso alfa-beta dalla forma chiusa alla forma aperta. A questo punto il complesso è nella conformazione tale da interagire col ligando; l'interazione determinerà l'innesco di segnali intracellulari. Abbiamo quindi un primo step di In-Out, dal citosol verso l'esterno, l'integrina così attivata interagisce col ligando (fibronectina, collagene, IgCAM) e ciò innesca i segnali Out-In.
La seconda parte è assimilabile a quello descritto per altri recettori, la prima è quello che differenzia il tutto. Tra le proteine reclutate sul versante intracellulare abbiamo quelle più importanti per innescare i segnali Out-In: la classica trasduzione del segnale: due chinasi (pp125 e pp59). Raggiunta la conformazione attiva l'integrina innesca i segnali dall'esterno verso l'interno. Un'alterazione della pp125 rende muto il segnale delle integrine. Vengono reclutate più di 50 proteine diverse e tra queste ritroviamo la SRC.
SRC è anche lei una tirosin-chinasi, non recettoriale, con un meccanismo di inibizione della sua azione in condizioni basali particolare: sul C-terminale è presente una tirosina fosforilata che interagisce con l'SH2 presente nella stessa molecola, inibizione intramolecolare; nel caso del signaling delle integrine, l'integrina recluta la pp125 che si autofosforila, queste tirosine sono molto attraenti per il dominio SH2 della proteina SRC. L'integrina nel momento in cui interagisce coi rispettivi ligandi può attivare una via di segnale che ricapitola quello che fanno i fattori di crescita: quindi le integrine mediano anche loro segnali di proliferazione, differenziamento o sopravvivenza.
L'Out-In signaling è più complesso ovviamente. Il complesso alfa-beta molto spesso si trova associato con altre proteine di membrana (caveolina, G-protein). Quello che è emerso dalla ricerca è che le integrine sono parte di un centro di integrazione di segnali di membrana attorno alle quali integrine possono essere reclutati diversi tipi recettoriali, ciò comportando una variazione significativa di quelle che sono le risposte. Per quanto riguarda gli aspetti puramente adesivi, strutturali, le proteine principali con funzione di adattatori sono essenzialmente l'alfa-actinina, la vinculina, la talina e la paxilina. Queste non hanno azione catalitica, servono essenzialmente a creare dei punti di approdo per le componenti del citoscheletro, in particolar modo l'actina. Questo non esclude l'interazione con le FAK, le integrine da un alto assolvono al loro compito strutturale tramite queste proteine adattatrici, dall'altro assolvono al compito di trasduzione del segnale tramite la pp125. Le adesioni focali sono delle adesioni dinamiche, destinate a crearsi e a distruggersi continuamente nel tempo. Questo avviene in maniera coordinata nello spazio per garantire la traslazione, il movimento della cellula. Data una cellula nell'istante x, abbiamo una serie di adesioni focali che compie con la matrice extracellulare.
Lamellipodia sono le estroflessioni, il tentativo della cellula di muoversi. La parte di cellula che ha creato questo lamellipodio creerà una nuova adesione focale un po' più in là. Nel frattempo le adesioni focali sulla coda della cellula devono essere smantellate. Nel tempo abbiamo la creazione di nuove adesioni nella direzione del movimento e lo smantellamento delle stesse nella direzione opposta. Questo si verifica con degli esperimenti di immunofluorescenza utilizzando anticorpi diretti contro le integrine, utilizzando cellule responsive ai segnali di migrazione, ed è possibile guardare la distribuzione delle integrine. Se alteriamo l'espressione delle integrine o la loro capacità di reclutare le proteine nominate fin'ora, abbiamo un impedimento sia allo spreading ma soprattutto alla motilità cellulare.
Le integrine fanno parte di centri di aggregazione dei segnali di membrana. È importante la capacità di interagire un cross-talk con altre molecole di membrana. Il reclutamento delle integrine è capace di determinare l'attivazione di recettori che si trovano vicini.
I complessi integrina-recettore possono attivare dei segnali esclusivi: l'integrina da sola attiva un certo tipo di segnali, il fattore di crescita da solo altri tipi di segnale, l'attivazione contemporanea attiva altri tipi diversificati di segnale. I segnali integrinici possono modulare quelli recettoriali. Il signaling può avere effetti di potenziamento ma alcune volte anche inibitori sul signaling di altri recettori. Il legame alle integrine determina l'assemblaggio di complessi di trasduzione. Integrine e recettori possono modulare reciprocamente i propri livelli di espressione. C'è un intreccio importante con tutte le classi di recettori che abbiamo definito in precedenza (anche recettori per neurotrasmettitori, non parliamo solo di interazione tra integrine e fattori di crescita).
Cooperazione tra integrine e fattori di crescita.
Il sinergismo tra i due è particolarmente evidente, da un lato perché c'è una convergenza sulla cascata delle map-chinasi, dall'altro perché le integrine innescano dei segnali capaci di determinare la degradazione di inibitori del ciclo cellulare, quindi allo stesso tempo le integrine schiacciano sull'acceleratore della proliferazione e tolgono il piede dal freno.
Morte cellulare programmata per anoikis.
Anoikis vuol dire senza casa, sta a indicare il processo di apoptosi che caratterizza quelle cellule che d'improvviso vengono deprivate delle loro interazione con la matrice extracellulare. La mancata attivazione delle integrine è causa della morte cellulare per anoikis.
Eventi biologici in cui intervengono le integrine:
• Impianto del trofoblasto; formazione della blastocisti, differenziamento della placenta;
• Durante lo sviluppo embrionale e post-natale, le integrine consentono alle cellule in divenire di trovare la loro corretta localizzazioen e andare incontro a differenziamento;
• Neovascolarizzazione;
• Cambiamenti ciclici e gravidici dell'utero e della ghiandola mammaria nei cicli di fertilità;
• Crescita del follicolo ovarico, ovulazione e formazione del corpo luteo nella second ametà del ciclo mestruale;
• Infiammazione e risposta immune; interazione tra cellule flogistiche ed endotelio, tra cellule immunocompetenti tra di loro;
• Tumorigenesi/Metastasi: l'alterazione nei meccanismi di controllo delle itnegrine è responsabile di alcuni aspetti dle processo neoplastico;
• Riparazione delle ferite.