Il dogma centrale della biologia definisce ed evidenzia i processi fondamentali tramite i quali l'informazione genetica, contenuta nel nucleo nella molecola di DNA, capace di autoreplicazione, si trasferisce al citoplasma. I geni del DNA vengono, nel nucleo, trascritti in una molecola di RNA messaggero, che, passando attraverso i pori della membrana nucleare, va nel citoplasma dove, a livello dei ribosomi, viene operata, tramite il codice genetico, la traduzione dal linguaggio dei nucleotidi a quello degli aminoacidi. Le proteine così sintetizzate sono i prodotti biologici, sui quali viene trasferita l'informazione genetica che così si rende "visibile" nella loro funzionalità.
Perché l'informazione possa essere trasmessa alla generazione successiva. il DNA viene ricopiato con elevatissima precisione eliminando eventuali errori attraverso un efficace meccanismo di riparo.
La duplicazione del DNA
Conservazione e trasmissione dell'informazione alle generazioni successive
Una peculiarità della duplicazione della molecola del DNA è che essa è semiconservativa come fu dimostrato da Meselson e Sthal nel 1957. Coltivando per molto tempo cellule in un terreno contenente solo azoto pesante (15N) e centrifugandone il DNA in un gradiente di densità di CsCl, osservarono un'unica banda (a) corrispondente all'azoto pesante. Le cellule furono poi trasferite in un terreno contenente solo azoto leggero (14N). Dopo la replicazione misurarono la densità del DNA trovando una banda di sedimentazione (b) ad un livello più alto (meno denso), risultato interpretato con la formazione di un ibrido (14N/15N). Continuando la replicazione per una generazione si producevano (c) due DNA ibridi e due DNA leggeri.
La sintesi del DNA inizia in un punto in cui la molecola viene preventivamente srotolata chiamato origine. Si forma così un'ansa di replicazione alla cui estremità troviamo le "forcelle di replicazione" e la sintesi può proseguire sia in una che in due direzione. Nel DNA batterico, circolare, le forcelle si incontrano in un punto della circonferenza opposto all'origine.
La sintesi del DNA è catalizzata da un gruppo di enzimi chiamati DNA polimerasi che possono sintetizzare solo se il punto d'allungamento è dato da una termin [acidi nucleici] azione 3'OH libera con direzione di crescita è 5'→ 3'. Poiché le eliche sono antiparallele, ne consegue che un'elica, chiamata catena leader, o stampo, viene letta e copiata nella direzione di avanzamento della forcella e procede in modo continuo e veloce. L'altra elica dovrà essere sintetizzata con ritardo e in modo discontinuo dovendo attendere lo srotolamento dell'elica veloce. Okazaki, biologo giapponese, scoprì che la catena discontinua viene sintetizzata, con frammenti, in direzione opposta all'avanzamento della forcella.
E' da tenere presente che ogni frammento di Okazaki termina con un'estremità 3'OH libera
Le DNA polimerasi catalizzano la reazione di addizione di un nucleotide ad una sequenza primer e necessita di uno stampo.
Come si vede in figura sotto, l'addizione di un nucleotide trifosfato avviene in direzione 5'→ 3'. Un fosfato legato al deossiribosio in posizione 5' del nuovo nucleotide si lega con legame fosfodiesterico al deossiribosio con terminazione libera 3'OH del primer. (nella figura il deossiribosio è rappresentato da quadratini). La reazione finale addiziona un nucleotide monofosfato liberando uno ione pirofosfato (PPi).
In conclusione le DNA polimerasi necessitano di uno stampo rappresentato dall'elica antiparallela per il corretto appaiamento delle basi e di un primer, molecola di innesco che fornisca una estremità 3'OH libera. Le DNA polimerasi possono aggiungere nucleotidi ad una catena preesistente, ma non cominciare una catena ex-novo. Spesso, l'innesco è un oligonucleotide di RNA potendo la RNA polimerasi cominciare a sintetizzare una catena ex-novo. In seguito questo breve tratto di RNA sarà rimosso da una RNAasi e sostituito da DNA.
E' rilevante osservare che tutte le DNA polimerasi hanno anche un'attività 3'→ 5' nucleasica capace di rimuovere eventuali appaiamenti sbagliati. Questa attività. chiamata proofreading, lettura delle bozze, rende molto precisa ed accurata la replicazione aumentata anche da altri sistemi enzimatici di riparo.
la reazione globale catalizzata dalle DNA polimerasi è: (dNMP)n + dNTP ———→ (dNMP)n+1 + PPi(deossiNucleotideMonoP) con n nucleotidi + deossiNucleotideMonoP ———→
Gli RNA e la trascrizione
Descriviamo adesso il flusso dell'informazione genetica che dai geni contenuti nel DNA porta alla loro espressione "visibile", il fenotipo, rappresentato a livello molecolare dalle catene polipeptidiche. Come vedremo, tutti i geni attivi vengono dapprima trascritti da un enzima specifico, l'RNA polimerasi, in RNA messaggero che sono molecole capaci di passare attraverso i pori delle membrane nucleari e portare l'informazione contenuta nel DNA alle macchine molecolari sede della sintesi proteica: i ribosomi. In pratica il linguaggio dei nucleotidi viene tradotto, a livello dei ribosomi, nel linguaggio degli aminoacidi. Questatraduzione viene eseguita seguendo un "dizionario" che è il codice genetico,
A parte alcuni RNA con funzioni catalitiche o regolatorie, nella cellula vi sono 3 tipi di RNA che partecipano al flusso dell'informazione genetica:
L'RNA messaggero (mRNA) è il prodotto della trascrizione di un gene del DNA ed uscendo dal nucleo porta ai ribosomi la sequenza dei nucleotidi che sarà tradotta in sequenza aminoacidica.
L'RNA transfer (tRNA) legge le triplette del mRNA (codoni) e trasferisce il corrispondente aminoacido alla sequenza polipeptidica in crescita.
L'RNA ribosomiale (rRNA) che associato a proteine forma i ribosomi, gli organuli sede della sintesi proteica.
La trascrizione e le RNA polimerasi
Le RNA polimerasi presenti nelle cellule degli eucarioti sono 3: la RNA polimerasi I, la II e la III. Solo la polimerasi II presiede alla trascrizione dell'RNA messaggero mentre la polimerasi I trascrive i precursori dell'RNA ribosomiale e la polimerasi III presiedono alla sintesi dell' RNA transfer.
[acidi nucleici] La polimerasi II è un grosso enzima composto di 12 subunità e che richiede molte altre proteine, i fattori di trascrizione, per formare il complesso attivo. Rispetto alla DNA polimerasi, la RNA polimerasi contiene una subunità, la σ (sigma), che riconosce le sequenze del sito di inizio sintesi sul DNA, chiamato promotore e quindi non necessita di un innesco. Essa è in grado di cominciare una catena ex-novo. Una delle differenze più macroscopiche tra la replicazione e la trascrizione consiste nel fatto che nella trascrizione dell'RNA viene copiata una sola elica ed un solo piccolo tratto di essa, cioè un gene.
L'azione della RNA polimerasi è quella di aggiungere unità ribonucleotidiche al terminale 3'OH libero. Essa sintetizza in direzione 5'→3' avendo come stampo l'elica del DNA in direzione 3'→ 5'e quindi l'RNA messaggero che ne risulta sarà copia dell'elica non stampo che è lacatena codificante. (vedi figura). In pratica l'RNA messaggero sarà una copia dell'elica 5'→3' con, l'uracile al posto della timina e il ribosio al posto del deossiribosio.
Per permettere la trascrizione, la doppia elica deve srotolarsi e aprirsi temporaneamente formando così una "bolla di trascrizione" che in figura scorre verso destra provocando lo srotolamento di altri tratti di DNA, mentre quello trascritto, a sinistra, si riavvolge. La sintesi di RNA procede fino ad un punto in cui la RNA polimerasi incontra sequenze sul DNA che favoriscono la sua dissociazione e la fine della sintesi. Il gene è stato completamente trascritto.
[La RNA polimerasi in E.Coli è un enzima di elevata complessità con un nucleo centrale costituito da cinque subunità e una sesta, chiamata σ, che si lega al nucleo dell’enzima in modo transitorio e lo dirige verso i siti di legame specifici del DNA, i siti promotori.]
Come copia la RNA polimerasi
(5’) CGCTATAGCGTTTT (3’) catena non-stampo (codificante) di DNA
(3’) GCGATATCGCAAA (5’) catena stampo di DNA
(5’) CGCUTUTGCGUUU (3’) trascritto di RNA
Modificazioni post-trascrizionali negli eucarioti
L'RNA messaggero che viene prodotto alla fine della trascrizione si chiama trascritto primario, ma in tutte le cellule eucariote questo RNA neosintetizzato subisce delle modificazioni post trascrizionali molto importanti.
Il trascritto primario degli eucarioti contiene tutta l'informazione genetica per codificare la produzione di una catena polipeptidica ma le sequenze utili, esoni, sono intercalate da sequenze non codificanti, introni, che dovranno essere rimossi con un processo chiamatosplicing. In questo modo gli esoni vengono riuniti a formare una sequenza nucleotidica contigua che specificherà per la sequenza aminoacidica funzionante.
L'RNA maturo, risultato delle modificazioni post trascrizionali del trascritto primario, degli eucarioti possiede ad un'estremità un cappuccio 5' e all'altra estremità una coda costituita da 150-200 residui di adenina: poli A. Le funzioni di queste due "appendici" non sono note del tutto anche se sappiamo che il cappuccio potrebbe partecipare al legame dell'RNA al ribosoma e che entrambe potrebbero contribuire a proteggere l'RNA dalle eventuali degradazioni enzimatiche. Tutte queste modificazioni avvengono nel nucleo, prima che l'mRNA lo lasci attraverso i pori della membrana nucleare.