CONTROLLO DEL CICLO CELLULARE E DELL'APOPTOSI: ASPETTI FARMACOLOGICI.
Datato storicamente, tutto inizia da osservazioni morfologiche. Al microscopio era già noto che le cellule nel loro ciclo vitale passare uno fase in cui la struttura cellulare veniva a modificarsi profondamente e questo avveniva immediatamente prima della divisione fisica in due cellule figlie. Per la metà del secolo scorso poche altre informazioni arrivavano rispetto a questo evento. A partire dagli anni '50, soprattutto con la scoperta e gli studi inerenti il DNA, inizia una corsa della ricerca a capire meglio i meccanismi che presiedono a questi cambiamenti morfologici. Si è capito il significato di quegli eventi morfologici rispetto alla duplicazione cellulare. A partire dagli anni '80 in particolar modo sono stati affrontati gli aspetti molecolari. Questa corsa ha portato a conoscenze fondamentali, tali da meritare il premio Nobel a Hartwell.
Ciclo cellulare.
Una serie di eventi concatenati tra di loro che partono da una condizione in presenza di una cellula madre vitale, e ritornano alla stessa condizione di partenza attraverso il passaggio della duplicazione fisica. Partiamo da una fase definita G1, per passare a una fase S e successivamente fase G2 e fase M. Tra fase S (sintesi del DNA) e fase M (mitotica) le fasi G (GAP) di intervallo. Queste fasi di intervallo non sono fasi in cui la cellula è quiescente o inattiva, anzi, c'è forte attività biosintetica della cellula. Chi regola molecolarmente l'ingresso della cellula nelle varie fasi? È l'azione concertata di due gruppi di famiglie di cellule: le chinasi ciclino dipendenti (cdk) e i corrispettivi partner, le cicline.
Si parla di partner perché la chinasi ciclino-dipendente si chiama così perché è una proteina la cui attività enzimatica dipende dall'accoppiamento con una corretta ciclina. La formazione di questi complessi ciclina-cdk sancisce il passaggio attraverso ciascuna delle fasi del ciclo cellulare. I gruppi che troveremo in ciascuna delle fasi del ciclo cellulare sono specifici, ci sono diverse cdk e diverse cicline che non sono in assoluto ridondanti tra di loro, anzi, creano una sorta di staffetta in cui questi complessi si modificano nel tempo per consentire il passaggio nelle varie fasi. Sono le protagoniste essenziali e rappresentano il motore del ciclo cellulare, ma un motore deve avere sempre un acceleratore, un catalizzatore, e un freno.
Insieme all'azione di queste due classi di proteine si intersecano le fosfatasi attivanti, chinasi inibitorie, chinasi attivanti e inibitori privi di attività catalitica.
Chinasi ciclino-dipendenti.
Sono proteine con attività fosfotransferasica, selettive per residui di serina e treonina. Sono ciclino dipendenti, ovvero avranno necessità, per sviluppare la loro attività, di legare le cicline. Le cicline sono diversamente espresse durante il ciclo cellulare. In fase G1 troveremo determinate cicline che spariranno nella fase S sostituite da altre, a loro volte saranno queste sostituite da altre nella fase G2 e poi nella fase M. Da un punto di vista strutturale riconosciamo tre regioni della proteina come essenziali nel loro funzionamento. Nell'Nterminale sono presenti due residui attaccati, una treonina in posizione 14 e una tirosina in posizione 15 con attività regolatoria sull'azione della cdk. Questi due aa sono oggetti di fosforilazione e defosforilazione sulla funzione della cdk. Spostandoci in direzione C-terminale troviamo un dominio definito T-loop, o loop di attivazione, in questa regione la cdk interagisce con la ciclina. All'interno del T-loop è presente un aa, treonina, che può essere oggetto di fosforilazione. Infine troviamo il dominio catalitico, un dominio fosfotransferasico.
Cicline.
Prive di attività enzimatica, rappresentano la subunità regolatoria del complesso ciclina-cdk. Sono codificate da geni diversi rispetto a quelli delle cdk che legano a livello del T-loop. Anch'esse sono sintetizzate e degradate in maniera fase specifica. La degradazione avviene così: le cicline presentano un dominio, CDB, in cui le proteine possono subire la reazione di ubiquitinazione. Le cicline ubiquitinate verranno poi mandate al proteosoma per essere degradate. I livelli delle cicline possono quindi essere finemente regolati nel tempo in maniera tale che raggiungano un livello massimo nella fase in cui devono svolgere la loro funzione. Rappresentano un elemento essenziale del complesso con le cdk.
Complesso cicline-cdk.
La cdk e la ciclina devono essere sintetizzate in primis. La cdk deve incontrare il proprio partner, ciascuna cdk ha una varietà limitata di cicline col quale può formare complessi, in alcuni casi c'è assoluta selettività. La regolazione di questo complesso è di natura positiva, attivante o di natura negativa. In primis a regolare positivamente il complesso è l'accoppiamento ciclina-cdk perché la ciclina interagendo col T-loop delle cdk cambia la collocazione spaziale di questo T-loop che abitualmente copre il dominio catalitico e rende la cdk pronta alle reazioni di fosforilazione. Dopodiché è necessario che intervengano dei complessi esterni, in particolar modo segnaliamo il complesso cdk7-ciclinaH: la ciclinaH lega solo la cdk7 e viceversa, è l'unico complesso ciclina-cdk a non subire sintesi e degradazione a seconda della fase del ciclo, è sempre presente attraverso tutte le fasi del ciclo cellulare; questo dipende dal fatto che l'azione di questo complesso (CAK) è essenziale per fosforilare il T-loop delle cdk fase specifica.
Perché è essenziale fosforilare questo T-loop? Perché l'aggiunta del gruppo fosforico nel T-loop serve a stabilizzare la conformazione aperta della cdk. La ciclina inizia ad aprire il groove catalitico, la fosforilazione del T-loop operata dal complesso CAK stabilizza questa conformazione. Un ultimo step serve per sviluppare alla massima potenza l'azione catalitica e consentire l'ingresso dei substrati nel dominio catalitico, si rimuovono gruppi fosforici da treonina e tirosina nell'N-terminale; se questi due aa sono fosforilati in realtà l'accesso al dominio catalitico è limitato, quindi la cdk non può manifestare il massimo della sua azione catalitica. Questi complessi dovranno a un certo punto inibiti e poi degradati.
La regolazione negativa richiederà l'azione di una chinasi, la WeeI, chinasi inibitoria che andrà a rimettere dei gruppi fosforici su questi aa e contemporaneamente l'azione di fosfatasi inibitorie (PP1, PP2A) che andrà a rimuovere gruppi fosforici dal Tloop. La cdk ritorna in una conformazione chiusa, il T-loop occupa l'accesso al dominio catalitico e la cdk smette di funzionare. Le famiglie di p21 e INK4 sono inibitori diretti endogeni delle cdk.
Qual è ilo significato finalistico di questi complessi? Attivare una cdk che avrà un determinato numero di substrati che nella maggior parte dei casi sono o altre chinasi o fattori di trascrizione che serviranno a sintetizzare nuove proteine connesse con il programma di duplicazione cellulare. Le cdk di fase G1 servono a produrre quelle proteine necessarie per la successiva fase S, e così via. I complessi ciclina-cdk sono diversi, sono caratterizzati da una fase-specificità. Questo è stato dimostrato con esperimenti di valutazione qualitativa e quantitativa di queste proteine durante le fasi del ciclo. In laboratorio si prende una popolazione di cellule, abitualmente distribuite in maniera caotica lungo il ciclo cellulare. Si può ottenere una sincronizzazione creando condizioni di arresto del ciclo cellulare, per esempio togliendo il siero o sottraendo uno dei nucleotidi essenziali per la sintesi del DNA (timidina). Affamando le cellule è possibile sincronizzare una popolazione nella stessa fase del ciclo, nella fase G0, al di fuori del ciclo cellulare. Nel momento in cui si reintroducono fattori di crescita le cellule partiranno tutte insieme per entrare nel ciclo cellulare, partendo dalla fase G1. È possibile poi fare uno studio analitico nell'espressione di cdk e cicline. Si fa con uno studio tipo western-blot. Operando in questa maniera è possibile verificare che le diverse cdk e cicline vengono espresse in maniera incostante e discontinua nell'arco di un ciclo cellulare.
È stato possibile studiare attentamente e caratterizzare la corretta localizzazioen dei complessi attraverso le fasi del ciclo:
• ciclina D in fase G1, crea rapporti con cdk 4 e 6
• ciclina E in fase G1/S con cdk6 e poi 2
• ciclina A in fase S + G2 con cdk2
• ciclina B in fase G2/M con cdk1
• ciclina H in tutte le fasi del ciclo con cdk7 (complesso CAK)
Altre funzioni:
• ciclina C onnipresente, fa parte della RNA polimerasi II
• ciclina F con picco come la A, stabilità e proteolisi delle cicline
• ciclina G indotta da p53 (ruolo nella neurodegenerazione in corso di AD)
• ciclina J
Alterazioni nel timing di espressione di queste proteine vengono sentite dalla cellula come eventi nocivi, pertanto innescano risposte di emergenza: bloccare l'ulteriore progressione del ciclo cellulare, indurre la morte della cellula.
Nella fase di passaggio, nel momento in cui la cellula ha preparato tutto per la successiva fase S è giunto il momento di porsi la domanda: sono in condizioni di andare incontro alla duplicazione del DNA oppure no? Molecolarmente questa domanda si configura nell'azione coordinata di alcune proteine. Il complesso E2F (fattore di trascrizione) e pRb (proteina del retinoblastoma) sequestrato nel citoplasma.
CDK4 (poi2) e ciclina
E lavora su pRb fosforilandola e liberando il fattore E2F che è libero quindi legarsi a DPI e di entrare nel nucleo e attivare la trascrizione di proteine che fanno parte del complesso della DNA polimerasi, di ciclina A e la cdk2 (proteine essenziali per la sintesi di DNA). La cellula ha espresso la decisione di andare avanti verso la fase S. Se impedisco la formazione del complesso E2F/DPI. Se ho notizia del fatto che l'informazione genetica piu' alterata, difettosa o incompleta non vado avanti nel ciclo cellulare.
Il sensore dell'integrità del DNA è p53, un fattore di trascrizione che sente le alterazioni del DNA per eventi che si verificano in precedenza. Ovvero situazioni come danni genotossici esterni dati da trasmissione di energia, raggi X, farmaci, molecole genotossiche, che determinano interruzione dell'integrità del DNA. Questi eventi creano delle estremità libere di DNA che saranno riconosciute dalle ATM/ATR, DNA-PK. Queste proteine vengono attratte sui monconi di DNA interrotto, nel momento in cui legano il DNA interrotto sviluppano la loro attività fosfotransferasica su p53 o su una proteina che inibisce p53.
Il risultato è quello di liberare p53 da una repressione e consentire il suo ingresso nel nucleo dove svolgerà l'azione di fattore di trascrizione. Viene stabilizzata l'espressione di p53 e viene modificata la sua localizzazione nella cellula. p53 va nel nucleo e fa sintetizzare p21 che funge da inibitore della duplicazione del DNA.
P21 si oppone all'azione del complesso di cdk2/ciclina E quindi non può liberare E2F. Il momento in cui forma il complesso ciclina E/cdk viene definito punto di restrizione del ciclo, punto di non ritorno superato il quale la cellula procede verso la fase S; questo punto di restrizione rappresenta il check point controllato da p53. Se qualcosa va storto nel programma regolato da p53 i danni sono importanti, irreparabili.
Esistono soggetti geneticamente determinati in senso negativo su questa via e hanno una certezza di andare incontro a trasformazione neoplastica, in particolar modo alterazione neoplastica della cute (la semplice esposizione ai raggi UV causa l'incapacità di fermare la mitosi delle cellule danneggiate).
Esistono check point nel corso del ciclo cellulare.
Quali sono gli effetti e le ragioni dell'attivazione di questi check point? Il risultato è quello di bloccare la progressione nel ciclo prima che si attui la duplicazione del DNA. L'attivazione di p53 porta anche alla trascrizione di proteine coinvolte nella riparazione del danno al DNA (c'è anche una funzione conservativa, curativa dell'asse p53). Se i sistemi di riparazione sono efficaci, se l'entità del danno non è eccessiva, questa cellula dopo una fase di blocco pre fase S rientra nel ciclo cellulare e prosegue correttamente. Se il danno è eccessivo, diffuso e incorreggibile, lo stesso asse p53 è in grado di attivare la morte cellulare programmata.
p53 è definita il gene oncosoppressore per antonomasia, guardiano del genoma. Parlando di p53 abbiamo detto che per svolgere la sua azione di blocco del ciclo cellulare che si configura con un inibizione del complesso ciclina E/cdk2, determina la sintesi di p21. Questo è il primo degli inibitori endogeni del ciclo cellulare.
P21 identifica una famiglia di questi inibitori, altri membri sono p57 e p27. Come principale target hanno i complessi ciclina/cdk che contengo cdk4 e cdk2. L'attivazione di queste proteine blocca il ciclo o in fase 1 o in fase S. Essenzialmente lo fa legandosi al complesso ciclina/cdk con un rapporto di due molecole di inibitore per un complesso. Alternativa all'azione di questi inibitori è quella delle famiglie delle INK4 ( Inhibitors of nuclear kinases) di cui fanno parte p18, p16, p15 e p19.
Le proteine di questo gruppo competono per il sito di interazione per la cdk con le cicline. Sono analoghi inattivi delle cicline. È una reazione competitiva rispetto alla ciclina. p19 non è un vero e proprio inibitore delle cdk, era messo nella stessa famiglia perché questa proteina è il risultato di una lettura alternativa dello stesso gene della proteine p16. In realtà da un punto di vista amminoacidico sono significativamente diverse, non si tratta di uno splicing alternativo classico in cui magari una parte, un dominio, non viene letta nelle due varianti; si tratta di una lettura alternativa del gene. p16 funziona come vero e proprio inibitore delle cdk e p19 in realtà è un attivatore della via di p53.
Perché un gene di questo genere si è dotato di una doppia possibilità di lettura? Perché controllare la progressione nel ciclo è uno step fondamentale che garantisce la sicurezza, l'integrità della cellula che si sta duplicando. Deve esserci un meccanismo di emergenza. Situazioni come parziali delezioni, metilazioni o mutazioni puntiformi a carico di questo gene avrebbero ripercussioni devastanti in termini di evoluzione verso la trasformazione neoplastica. Abitualmente il complesso ciclina/cdk ha la funzione di fosforilare la proteina del retinoblastoma per poi attivare la sintesi di DNA polimerasi e la transizione verso la fase S. Se si vuole inibire questa transizione una possibilità è quella di attivare la lettura della p16.
Se per eventi mutazionali p16 non può essere letta ma è preservata la lettura alternativa di p19, la proteina viene sintetizzata e determina una rimozione dell'inibitore di p53 che si stabilizza, aumenta la sua stabilità e fa sintetizzare p21: il risultato è comunque quello di inibire questo step. Un evento potenzialmente drammatico come la mancata lettura di p16 può quindi essere recuperato con la lettura alternativa di p19.
Il check point nella fase G1-S non è l'unico.
Esistono check point durante la fase S in cui viene verificato un corretto completamento della mitosi precedente (che non ci sia stata una mitosi abortiva). Si controlla che ci sia un equilibrio tra gli stimoli proliferativi dati dall'esterno e l'adeguata sintesi di proteine necessarie al completamento delle fasi precedenti: per esempio che permanga l'espressione di ciclina D. Lo stesso per quanto riguarda check point presente al passaggio tra la fase G2 e la fase M. In questo caso viene controllato che sia avvenuta e completata la duplicazione del DNA, che ci sia un'adeguata sintesi proteica che riguarda le strutture inerenti il fuso mitotico e ancora una volta che il DNA sia integro. Il controllo dell'integrità dipende dalla corretta espressione dei membri di p53.
C'è un altro check point importante all'interno della fase M. Nella fase M avviene il compattamento massimo del DNA e formazione dei cromosomi, allineamento dei cromosomi sul piano equatoriale del nucleo, assemblaggio del fuso mitotico che dai poli vanno verso i cromosomi per prendere contatto a livello del centrosoma. La corretta struttura è data da due poli del fuso mitotico, questi fasci di microtubuli che vanno verso il piano equatoriale si agganciano ognuno a un cromatide. Questa è la struttura che si deve verificare correttamente e la correttezza è essenziale per stabilire il check point di fase M. Ogni qualvolta un cromosoma sia privo di legami al fuso mitotico o per esempio ambedue i cromatidi sono legati allo stesso polo, viene a mancare una energia di trazione data dalla tensione tra i poli opposti che innesca delle reazioni molecolari. In questo caso viene bloccata la degradazione della ciclina B essenziale per entrare in un nuovo ciclo cellulare. Rimangono livelli alti di ciclina B, la cellula viene bloccata nella fase M e si impedisce di andare incontro a una segregazione anomala di cromosomi. Questo check point a differenza di quelli precedenti controlla l'integrità strutturale dei cromosomi e del fuso mitotico e il risultato di una anomalo arrangiamento dei cromosomi è l'innesco di un blocco della progressione del ciclo ed eventualmente l'autoeliminazione della cellula per apoptosi che non dipende da p53. Nel check point di fase M non è coinvolta la via di p53.