La struttura portante della membrana cellulare è un doppio strato di (fosfo)lipidi strettamente giustapposti praticamente impermeabili agli ioni (più concentrato sul versante extracellulare Na, sul versante intracellulare Cl) e alle molecole polari (zuccheri, amminoacidi). Queste particelle possono attraversare la membrana solo con la mediazione di speciali proteine transmembrana, dette proteine di trasporto o canali di membrana. Le proteine transmembrana che agiscono da carriers per gli ioni e per molte molecole organiche. Tra queste, alcune trasportano le particelle contro gradiente elettrochimico, trasporto attivo. I canali ionici sono una famiglia eterogenea di proteine di membrana capaci di svolgere compiti fondamentali per la vita della cellula, essi trasportano secondo gradiente.
Le mutazioni genetiche, che portano ad un disordine nel funzionamento di un canale, hanno conseguenze dannose e spesso disastrose per l'organismo (canalopatie). I canali ionici sono un ottimo bersaglio molecolare per lo sviluppo di nuovi farmaci.
Caratteristiche strutturali comuni dei canali:
• arrangiamento oligomerico con simmetria
• le dimensioni del poro dipendono dal numero di subunità: 4 voltaggio-dipendente e recettori per il glutammato, 5 ligando-dipendenti, 6 connessine Ogni canale ionico è costituito da un certo numero di subunità proteiche disposte in un cerchio in modo da delimitare un poro transmembrana contenente acqua.
La struttura dei canali ioni e le proprietà funzionali che ne derivano sono diversificate, due aspetti sono molto importanti:
• gaiting: quando e perché il canale permette il passaggio degli ioni, si apre solo in seguito a un preciso segnale
• selettività
Meccanismo di GATING: il poro interno al canale per effetto delle vibrazioni/variazioni conformazionali spontanee delle subunità, può passare ciclicamente da uno stato chiuso (impermeabile agli ioni) ad uno stato aperto in cui gli ioni passano mediamente ad una velocità di 10^6 secondi, più o meno lo stesso flusso che si avrebbe nella diffusione libera. Il termine gating indica il processo per cui un fattore, o più fattori, privilegia la permanenza di una certa classe di canali nello stato aperto o nello stato chiuso. Le tipologie possono essere:
• canali di leakage: restano sempre aperti (canali senza gating). Fisiologia: canali K (il suo potenziale sarebbe -90 ma non è così negativo per l'esistenza di questi canali), potenziale di membrana in condizione di riposo (-50, -70 mV)
• stretch-channels o mechanosensitive-channels: la distensione della membrana. Fisiologia: meccanorecettori, es. corpuscoli di Pacini, cellule cigliate dell'orecchio interno
• variazione di voltaggio: l'apertura o la chiusura sono determinati dalla variazione del potenziale transmembrana. Fisiologia: potenziale d'azione, cellule nervose e muscolari
• variazione di ligando: l'apertura o la chiusura è determinata dal legame di mediatori extracellulari coi rispettivi recettori membranali. In questo caso il gating del canale può essere: diretto come nel caso dei recettori per i neurotrasmettitori quando il sito recettoriale fa parte del canale, indiretto quando il sito recettoriale per il messaggero extracellulare è situato altrove nella membrana, l'apertura del canale è determinata dalla formazione di secondi messaggeri che agiscono sul versante intracellulare del canale.
Canali Na voltaggio-dipendenti.
Sono formati da 4 motivi a 6 segmenti transmembrana che si arrangiano attorno a un centro di simmetria per formare il poro. Il canale del Na voltaggio-dipendente ha due cancelli: di attivazione e di inattivazione. Al potenziale di riposo il cancello di attivazione è chiuso. È diverso ciò che chiude il canale quando siamo in una condizione di riposo, rispetto a quello che lo chiude durante il periodo refrattario. La differenza è che nella condizione di riposo il canale deve essere recettivo, quindi deve essere in grado di aprirsi, mentre nella condizione refrattaria il canale non deve essere in grado di aprirsi di nuovo per evitare un'ipereccitazione della cellula. Il gating voltaggio-dipendente dipende dalla capacità di una proteina di questo modulo sensibile alla variazione di potenziale, ed essa si trova nel quarto dominio, tra il 5 e il 6 abbiamo un'ansa P, qui si trova il vero e proprio cancello di chiusura del canale durante il periodo di riposo, mentre la chiusura per il periodo refrattario amminoacidi dominio C-terminale.
Le regioni S4 dei canali contengono aminoacidi carichi che si muovono in risposta ai cambiamenti di voltaggio, si spostano dal versante intra a quello extracellulare, ciò causa l'apertura del canale. In depolarizzazione il cancello di attivazione si apre: Na entra (depolarizza) fino all'inversione della polarità della membrana (tende al valore del potenziale di equilibrio di Na). A +35 mV (potenziale di inversione del Na, le correnti in entrata e in uscita di Na si equivalgono) il potenziale è invertito e il cancello di inattivazione si chiude, le cariche positive sono concentrate maggiormente all'interno. Un canale inattivato è temporaneamente impermeabile agli ioni. (Il limite della depolarizzazione è -120 mV, una cellula si iperpolarizza per ingresso di ioni Cl, -120 mV è il potenziale di inversione del cloro = correnti in entrata e in uscita del cloro si equivalgono) Se il canale dipendesse per la sua chiusura dallo stesso cancello che lo apre, servirebbe un tempo troppo lungo, mentre l'eccitazione della membrana deve essere molto rapida e quindi anche la sua chiusura, per questo utilizza un canale molto più sensibile, che dipende da un dominio N o C-terminale che si ripiega a chiudere come un tappo il canale dal versante intracellulare, quindi temporaneamente si ha una totale impermeabilità agli ioni, quindi si entra nella fase di refrattarietà. In seguito la fase di ripolarizzazione dipende dall'apertura dei canali del K, quindi il ripristino verso le condizioni di riposo permette al tappo di scostarsi, e far tornare il cancello nelle condizioni iniziali, in modo che in seguito all'arrivo di un nuovo stimolo potranno aprirsi di nuovo, tornano quindi recettivi.
Inattivazione dei canali, modello ball and chain:
• inattivazione: i canali impediscono il passaggio di ioni anche in presenza di una depolarizzazione
• meccanismo di gate differente da quello in fase di attivazione: ball and chain (non esclusivo) Il dominio ball si trova su un braccio flessibile del canale, è costituito da un cluster di amminoacidi.
Mutazioni e trattamenti enzimatici proteolitici, che eliminano il dominio ball comportano un'inappropriata serie di cicli di apertura del canale. Mentre il Na è uno ione e quindi determina delle risposte fisiologiche attraverso il potenziale di membrana, nel caso del Ca è più complicato perché non è solo uno ione anche un secondo messaggero, quindi non contribuisce solo al potenziale ma anche all'attivazione di enzimi. Per questo è necessario che la concentrazione degli ioni Ca siano sempre sotto un fine controllo. Abbiamo una struttura linker tra il modulo 1 e 2, 2 e 3, 3 e 4, la subunità α1 è quella che costituisce il canale. L'inattivazione del canale Ca voltaggio-dipendente è data dal dominio N-terminale che consente l'interazione con la subunità β. Linker I-II, III-IV si richiudono sui domini S6 durante l'inattivazione. Dominio C-terminale interagisce con complessi Ca/CaM modulando la velocità di inattivazione in funzione delle concentrazioni del Ca. La calmodulina è una proteina capace di legare fino a 4 ioni Ca, l'affinità per il Ca aumenta dal primo al secondo legame, dal secondo al terzo e così via, il legame con il Ca porta ad un cambiamento conformazionale che porta a una risposta diversa. Le subunità β sono componenti citosoliche del canale necessarie per la corretta collocazione ed il normale funzionamento della subunità α.
Oltre al gating dipendenti dal potenziale di membrana e dai complessi Ca/Cam, tali canali sono modulati:
• fosforilazione: cAMP-dipendente • proteine G: modulazione da complessi β-γ
• proteine effettrici: quali RyR e proteine SNARE
Abbiamo visto quali sono gli eventi che determinano il gaiting (apertura del canale) e quali sono le strutture preposte alla chiusura del canale. Sottolineato l'esistenza di domini coinvolti nell'apertura del canale (differenti da quelli che determinano la chiusura). La chiusura immediata dopo l'attivazione è il presupposto essenziale per il periodo refrattario (fondamentale per un corretto funzionamento). Abbiamo descritto i domini e il modo di funzionare di un canale ionico un po' più semplice (voltaggio-dipendenti per sodio e potassio). Abbiamo detto che c'è qualcosa di più complesso che riguarda i canali per il calcio dove la difficoltà sta nella raffinatezza della regolazione, assolutamente necessaria dato che questo non è solo uno ione ma anche un secondo messaggero. La regolazione delle concentrazioni del calcio è una questione di vita o di morte per la cellula perché superati determinati livelli intracellulari il calcio è responsabile dell'innesco di eventi catastrofici per la cellula (apoptosi, incrementi ancora superiori sono responsabili della necrosi). La subunità α1 costituisce di per sé il canale e funziona come i canali del K e del Na, poi ci sono altre subunità che interagiscono con α1 (β per esempio e altre). L'altro aspetto fondamentale che descrive i canali ionici e che discrimina le differenze è la SELETTIVITA'. Si tratta di canali presenti nella membrana ma che non consentono il passaggio a qualsiasi cosa: c'è un certo grado di selettività. La selettività può essere alta (possibilità di far passare una singola specie ionica) oppure selettività meno ristretta. Essenzialmente questi ultimi concedono il passaggio o ai cationi o agli anioni (la selettività principale è riferita alla carica). La maggior parte dei recettori canale (soprattutto di tipo eccitatorio) rientra in questo tipo di selettività.
Permeabilità agli ioni dei canali “specifici”:
• Na → “Upstroke del potenziale d'azione
• K → Depolarizzazione rapida durante il potenziale d'azione; controllo dell'eccitabilità/intervalli “ interspike”
• Ca → Depolarizzazione (Ca potenziale d'azione); Incrementi nella concentrazione del calcio intracellulare, e.g. apertura dei canali K Ca dipendenti
• Cl → Iperpolarizzazione della cellula Canali voltaggio-dipendenti del potassio. Hanno 6 domini. Il quarto attraversamento è importante per il gating, mentre per la selettività è importante l'ansa tra gli attraversamenti 5 e 6. Questi non sono perpendicolari alla membrana stessa e non sono paralleli tra di loro, hanno un angolo di inclinazione. Riunendo le 4 subunità questi attraversamenti tendono a convergere verso il centro del canale. Questo contribuisce a occludere il canale quando questo non è attivato. Questo avvicinamento è fondamentale per creare il meccanismo di filtraggio e di selezione che però dipende essenzialmente dall'ansa H5. In quest'ansa sono presenti aminoacidi identificati come fondamentali per conferire la selettività al canale (consensus sequence: Thr-Val-Gly-Tyr-Gly), mutando uno più degli aminoacidi citati sparisce la selettività. Gli ioni K devono attraversare questa prima parte del canale e qui avviene il passaggio essenziale per definire la selettività: gli ioni K attraversano il canale non da soli ma insieme a molecole di acqua, l'esito finale (attraversare il canale) dipende dalla capacità del canale stesso di deidratare questi ioni potassio in modo da far passare gli ioni come ioni isolati. La deidratazione del potassio è garantita dal fatto che impiegando il canale e passando nell'ansa H5 entra in contatto con degli ioni ossigeno: ciascuna ansa fornirà degli ioni ossigeno. Vi deve essere un contatto contemporaneo con tutti i punti dell'anello per permettere la perdita delle molecole d'acqua. Dove sta la selettività? Sta proprio nella distanza tra i 4 atomi di ossigeno che formano l'anello: nel canale del potassio questa distanza è tale da poter deidratare lo ione potassio ma è eccessiva per quanto riguarda gli ioni sodio che sono di dimensioni più piccole. Lo ione quindi nel momento in cui impegna il canale fa collassare questo anello di atomi di ossigeno, le distanze non sono tali da consentire la deidratazione. Il canale nel momento in cui dovesse arrivare lo ione sodio si chiude.
Canali Na voltaggio-dipendenti.
Li troviamo in tutte le cellule citabili, essenziali per la prima fase del potenziale d'azione.
Canali K voltaggio-dipendenti.
Correnti in uscita, fondamentali per la ripolarizzazione.
Canali Ca voltaggio-dipendenti.
Sono un po' più diffusi e gestiscono funzioni un po' più complesse
• Modulazione dell'attività dei canali ionici: i livelli di calcio possono regolare l'apertura di altri canali
• Potenziali d'azione Ca-dipendenti (Fase 1 e 2); le correnti di cariche positive in alcuni distretti preponderanti rispetto alle correnti del sodio • Rilascio neurotrasmettitoriale
• Trasduzione del segnale: protein chinasi e fosfatasi che dipendono dal calcio
• Accoppiamento eccitazione/contrazione (muscolo)
• Secrezione ormonale: l'insulina dipende molto dagli aumentati livelli del calcio
• Regolazione genica
• Fertilizzazione • Morte cellulare (apoptosi)
I canali voltaggio-dipendenti (in particolar modo Na e Ca) nel loro ciclo di funzionamento sono caratterizzati da 3 fasi:
• fasi di riposo in cui il canale è in uno stato chiuso
• stato attivato in cui la conformazione aperta è probabilisticamente più frequente rispetto a quella chiusa (connessa agli eventi di ripolarizzazione)
• stato inattivato o refrattario: stato di blocco dipendente dal sistema “ball and chain” caratterizzante la fase di refrattarietà (che determina la frequenza massima dei potenziali d'azione cioè la velocità di recupero dell'inattivazione)
I farmaci che bloccano i canali del sodio mostrano affinità selettive per uno di questi stati funzionali con modalità uso- o voltaggio-dipendente:
• anestetici locali
• farmaci antiaritmici
• farmaci antiepilettici
• farmaci anti diabetici
Uso-dipendente vuol dire che un canale che non è stato attivato non passando attraverso la fase di refrattarietà non può legare il farmaco, quindi deve esserci quindi precedentemente un evento di stimolazione in modo che il canale si apra, poi si chiuda e di conseguenza sia utilizzabile.
Voltaggio-dipendenti: si tratta di farmaci fortemente carichi (positivamente), solo nel momento in cui c'è una variazione di potenziale (corrente che favorisce l'ingresso di questi farmaci all'interno della cellula) il farmaco potrà svolgere la sua funzione. Una cosa importante è la loro capacità di integrarsi nella funzione. Ne abbiamo visti di tipi diversi (sodio, potassio Ca). Questi canali non funzionano parallelamente e sconnessi gli uni gli altri visto che sono connessi. La funzione integrata di questi canali ionici è alla base del corretto funzionamento della cellula. Un'alterazione di questo coordinamento può essere alla base di uno stato patologico che può essere in qualche maniera aggiustata agendo tramite farmaci.