I fattori di crescita è un capitolo importante del funzionamento soprattutto di un organismo multicellulare perché consente comunicazione. È un ambito che basa il suo funzionamento sull'azione di particolari proteine, dotate di attivita fosfotransferasi. Proteine che usano l'ATP per trasferire il gruppo fosfato su aa di proteine target.
Gli aa oggetto di fosforilazione sono 3: tirosina, treonina e serina.
• Protein chinasi tirosin specifica
• Protein chinasi serin treonina specifica
Esiste un codice di riconosciumento rappresentato dagli aa immediatamente immediatamente vicine a quel target (tirosina, treonina o serina). Questo codice è dato dalla sequenza amminoacidica definita come sequenza consenso. Ciascuna delle protein chinasi è caratterizzata dal riconoscimento di una sequenza consenso più o meno selettiva. U
n'altra classificazione di queste protein chinasi riguarda la loro tipologia di attivazione. Quella più ampiamente utilizzata:
• Gruppo AGC: PKA, PKG, PKC, Rac, “G-protein kinases”
• Gruppo CaMK(calcio calmodulina dipendenti): chinasi regolate da calcio e calmodulina
• Gruppo CMGC: “cyclin-dependent kinases”, ERK, MAP, Casein-chinasi
• Gruppo PTK: tirosin-chinasi convenzionali Src, Abl, Fak, PDGFR, IR, NGFR
• OPK: “Other Protein Kinases”
I fattori di crescita sono fattori diffusibili, primi messaggeri rilasciati nell'ambiente extracellulare che una volta incontrata una cellula dotata di opportuni recettori, innesca delle risposte in questa cellula. E le innesca attivando un recettore che è la tirosin chinasi. La storia della ricerca sui fattori di crescita inizia con gli studi della prof. Montalcini (Premio Nobel nell'86) negli anni '40. Furono ispirati dagli studi di uno studioso tedesco, studi un po' cruenti. Victor Amburg aveva fatto osservazioni sulla capacità di rigenerare parti di organi negli embrioni di pollo. La Montalcini scoprì la presenza di un fattore in grado di stimolare la formazione di propaggini nei precursori del sistema nervoso, quindi di favorire la crescita assonale e di favorire la ricrescita di nervi che potevano essere troncati chirurgicamente: diete a questo fattore il nome di Nerve Growth Factor. Gli studi andarono avanti non con poche difficoltà dati gli anni e la sua origine ebraica e culminarono nell'86 nel Premio Nobel. Gli studi sul mondo dei fattori di crescita hanno avuto importanti contributi in tutto il mondo, ma uno in particolare è arrivato nell'ultimo decennio dagli studi di Napoleone Ferrara. Italiano quasi costretto ad emigrare negli USA, ha studiato con Canonico e la nostra università gli ha conferito la laurea honoris causa. Le applicazioni relative al NGF a tutt'oggi sono praticamente nulle, non sono stati studiati degli strumenti farmacologici che insistano su questo sistema. Mentre per quanto riguarda il Vascular Endothelial Growth Factor (scoperto da Ferrara), la sua conoscenza ha consentito di curare una maculopatia degenerativa causa di cecità nell'anziano. Nel momento in cui c'è il binding del ligando e del recettore si innescano dei movimenti all'interno della cellula che portano in molti casi all'innesco della duplicazione cellulare o al differenziamento. Anche la risposta immune dipende dalla reazione di fattori di crescita. Il differenziamento delle cellule, il loro commitment, il loro dedicarsi a una determinata azione dipende da segnali innescati da fattori di crescita. Quindi controllo duplicativo ma non solo.
Qual è il risultato dell'alterato funzionamento di questi fattori di crescita? Una mancata attivazione del segnale può essere causa di difetti di sviluppo e accrescimento, anche fisicamente staturale, ponderale dell'organismo: alcune forme di nanismo sono dovute alla mancanza genetica di recettori (per esempio quelli per molecole definite IGF-like) che determinano una mancata maturazione, accrescimento, dell'organismo. D'altra parte la eccessiva attivazione dei fattori di crescita, dei recettori, ecc, è responsabile in molti casi delle malattie iperproliferative (neoplastiche). Questo è confermato dal fatto che esistono forme di tumore in cui si riconosca l'iperattivazione di tirosin-chinais alterate o per esempio di origine virale. La storia dei fattori di crescita è strettamente collegata all'attività catalitica del trasfeirmento del gruppo fosfato.
Queste protein chinasi sono essenzialmente di due tipi: citosoliche o di membrana.
Quelle di membrana sono i recettori per i fattori di crescita.
I recettori vengono suddivisi in famiglie che vengono a essere identificate per il nome del recettore capostipite della famiglia:
• EGF-receptor, NEU/HER2, HER3
• Insulin receptor
• PDGF-R
• FGF-R
• VEGF-R
• Eph-R
• NGF-R (Recettori per le neurotrofine)
Il NGF non esiste solo nel sistema nervoso ma in qualsiasi distretto e tessuto del nostro organismo. Lo stesso vale praticamente per tutti gli altri fattori di crescita, per il VEGF in realtà c'è una selettività, questo fattore di crescita può essere prodotto un po' ovunque ma è recepito solo dalle cellule endoteliali. Non prendiamo la lettera iniziale come una discriminante della collocazione del fattore di crescita. I recettori per i fattori di crescita sono proteine di dimensioni importanti, sopra i 100 kD, il che vuol dire molto spesso tra gli 800 e i 1200 aa. Si tratta di proteine molto spesso modificate con glicosilazioni, soprattutto nei domini extracellulari.
Possiedono un'estremità N extracellulare, responsabile del binding con il corrispettivo ligando. Questo segmento è di una lunghezza pari o superiore ai 200 aa.
Poi abbiamo un dominio transmembrana, corta sequenza amminoacidica, grosso modo lunga 50 aa con caratteristiche chimiche specifiche (aa apolari che consentono il passaggio attraverso la membrana e questo conferisce una minore differenza tra i vari recettori).
Poi abbiamo un dominio iuxtamembrana, un po' più grande (100 aa) importante per la modulazione del segnale.
Poi abbiamo il dominio catalitico intorno ai 250 aa responsabile dell'attività fosfotransferasica.
Infine l dominio C terminale di 200 aa anche questo coinvolto nell'attività biologica.
Dominio extracellulare (N-terminale).
Serve all'interazione con il ligando. La loro interazione con i recettori forza l'accoppiamento di due molecole recettoriali → dimerizzazione nell'innesco dei segnali dati dal fattore di crescita. Questa dimerizzazione (accoppiamento dei due domini extracellualri) innesca die cambiamenti conformazionali che vengono trasmessi prima al dominio transmembrana (ruotare dell'alfa-elica che attraversa la membrana) e poi al dominio iuxtamembrana (reazione domino).
Dominio transmembrana.
Serve per una corretta collocazione della proteina nascente, pian piano che la sequenza nasce, se presenta un dominio transmembrana, viene inserito nella membrana del reticolo endoplasmico.
Dominio iuxta-membrana.
L'ativazione del recettore is deve tradurre nell'innesco di una serie di proteine target all'interno della cellula, il reclutamento dipende da quel eh avviene nel dominio iuxtamembrana. Determina la desensitizzazione del segnale, regola l'entità della risposta (per quanto deve perdurare l'innesco) e le possibilità di cross-talk.
Dominio catalitico.
Strutturalmente deve essere considerato come costituito da due lobi. Gli aa si raggruppano in due cluster, uno più vicino alla membrana e uno più vicino al C-terminale; questi due lobi si accostano nel momento in cui viene innescato il segnale. Il lobo più vicino alla membrana è quello che lega l'ATP, mentre il lobo più vicino al C-terminale è quello in cui c'è l'aa catalitico (aspartato). In pratica l'N-terminale di questo dominio porta l'ATP che fornisce gruppi fosfato lì dove poi verrà catalizzata la reazione. Sul lobo C-terminale si va a inserire il substrato che dovrà essere fosforilato. C'è uno step prima che vengano fosforilate altre proteine. La prima fosforilazione che il recettore fa la fa a carico di se stesso, aa presenti sulla propria sequenza. Nel lobo C terminale esistono due anse amminoacidiche, una definita ansa catalitica (con su l'aspartato) e un'altra definita ansa o loop di attivazione. Questi cambiamenti conformazionali fanno sì che le tirosine presenti nell'ansa di attivazione vengano a essere fosforilate dall'ansa catalitica. L'aggiunta di gruppi fosforici crea forze di repulsione che aprono la nicchia catalitica che consentono l'arrivo di substrati. Questi substrati sono estrinseci, al di fuori del recettore, presenti nel citosol, ma possono essere aa presenti anche sull'altra molecola recettoriale.
Dominio C-termianle.
Dominio in cui sono contenute più tirosine fosforilabili. Serve al reclutamento di trasduttori sui siti di fosforilazione, per le interazioni con il citoscheletro importanti per l'endocitosi e anche lui nel cross-talk recettoriale.
Step dell'attivazione:
1. Cambiamento conformazionale: il ligando interagendo con il recettore ne modifica la struttura ed arrangiamento spaziale (dimerizzazione)
2. Dimerizzazione: due molecole di recettore sono “forzate” ad interagire dal legame con il rispettivo ligando (binding)
3. Trans/autofosforilazione sul loop di attivazione
4. Transfosforilazione sui domini juxta-membrana e C-terminale
Recettori per fattori di crescita: l'EGFR.
La trans/autofosforilazione ha il compito di creare una serie di tirosine fosforilate. Queste sono punti di approdo per i trasduttori del segnale. Unica differenza rispetto alla dinamica che abbiamo detto (due monomeri che formano un dimero attivo) si ha nel signaling dell'insulina.
L'insulin-receptor è costituito da due subunità. C'è una ripartizione delle funzioni: la subunità alfa è indispensabile per il legame per reclutare il ligando e la subunità beta è dotata dell'attività catalitica: per il resto non cambia nulla. Come fanno queste proteine ad essere reclutate e a riconoscere le tirosine fosforilate? Possiedono all'interno della loro sequenza amminoacidica un gruppo di aa che costituiscono il dominio SH2 (sarc homology domain 2). tutte le proteine che presentano und ominio SH2 sono atte a riconoscere tirosine fosforilate. Delle proteine dotate di dominio SH2 dobbiamo fare una suddivisione: alcune funzionano esclusivamente da adattatori (IRS, Grb2 e Shc) prive di attività catalitica (stessa funzione degli adattatori delle prese di corrente) e altre funzionano da trasduttori (PI-PLCgamma, PI3Kinase, Crs e STAT) con attività catalitica vera e propria.
Il presupposto fondamentale è la trans/autofosforilazione.
La proteina Sarc è prodotta d aun virus responsabile della trasformazioen sarcomatosa in alcune specie aviarie. In quel settin sperimentale si scoprì che questa proteina era dotata di attività fosfotransferasica e si scoprì che esisteva una proteina simile codificata dal genoma umano, appunto la proteina Sarc. Questa proteina ha una serie di domini strutturali. I domini vengono denominati con un numero progressivo preceduto dalle due lettere SH.
Ci sono 4 domini sarcomologi: S1, S2, S3 e S4.
S4 è il dominio N-terminale in cui sono presenti dei residui fosforilabili, importante per l'interazione con altre proteine.
S1 è il dominio catalitico, sul versante C-terminale: all'interno sono presenti tirosine che in condizioni normali sono fosforilate. Queste tirosine fosforilate servono a mantenere la condizione di spegnimento della chinasi. Accanto al dominio SH1 è presente il famoso dominio SH2. Le tirosine presenti nell'SH1 si richiudono ed interagiscono con SH2 quando la proteina è inattiva. Il dominio SH3 interagisce con sequenze amminoacidiche ricche in prolina che si trovano sempre sull'estremità C terminale. La chiusura in condizioni di spegnimento è data dalle tirosine fosforilate che interagiscono con le SH2 e dalle sequenze ricche in prolina con SH3. Questa chinasi si attiva nel momento in cui incontra delle proteine fosforilate con una sequenza verso al quale ha una maggiore affinità il dominio SH2 oppure per defosforilazione di queste tirosine. Rimuovendo i gruppi fosforici interrompe l'interazione intramolecolare: a questo punto il dominio catalitico è aperto e potranno essere reclutati dei substrati per svolgere la sua funzione. Tra i trasduttori più importanti reclutati a livello del signaling recettoriale per i fattori di crescita un posto fondamentale ce l'ha la proteina Ras.
La proteina Ras è una small G protein, ma ha una funzione non motrice nel citoplasma ma piuttosto di trasduzione di segnali. Utilizzando alcune cellule si è scoperto che è possibile stimolar e la proliferazione cellulare fornendo dall'esterno dei fattori di crescita. D'altra parte posso impedire il passaggio verso la duplicazione introducendo nella cellula un anticorpo neutralizzando la proteina Ras che le impedisce di legare il GTP. In questo caso non importa quando fattore di crescita forniscono, questa cellula se è quiescente rimane tale. Viceversa per comprovare l'importanza della proteina Ras posso introdurre dentro la cellula una forma mutante di Ras che sia costitutivamente attiva: anche in assenza del fattore di crescita avrò induzione della proliferazione. Questi tre esperimenti confermarono la centralità della proteina Ras nella proliferazione cellulare.
Drosophila melanogaster.
L'occhio è un insieme di telecamere che mandano segnali al SNC che in qualche maniera il moscerino riaccorpa e rianalizza. Ciascuna telecamera è fatta da un numero limitato di cellule: le unità si chiamano ommatidi. All'interno degli ommatidi è presente una fila di cellule, retidule, e una serie di tronchi nervosi che vanno verso il SNC. C'è un'unica cellula di tipo retidulo che si trova su una fila coperta: la cellula 8 interagisce con la cellula 7. Studiando l'interazione tra queste due cellule si sono scoperti importanti meccanismi di dialogo cellula-cellula. La cellula 8 fornisce segnali trofici alla cellula 7, se si interrompono queste interazioni la cellula 7 cambia il suo tipo di differenziamento: questa conferisce la capacità di vedere nella radiazione UV. Si è scoperto che i segnali trofici innescati dalla c8 che inducono il differenziamento della c7 non sono dovuti a un messaggero diffusibili ma a un'interazione diretta di membrana. Cosa si innesca all'interno della cellula tale da portare al differenziamento verso un recettore per la radiazione UV? Si scoprì che alterando l'espressione della proteina Sos o di Ras, che lavorano di concerto fra di loro, era possibile bloccare il differenziamento e rendere il moscerino cieco per la visione UV.
In assenza di Sos o del recettore era possibile riattivare il differenziamento determinando l'espressione di una proteina Ras costitutivamente attiva. Gli studi iniziati sull'occhio del moscerino hanno consentito di tracciare una via di segnale molto importante. L'attivazione di ras passa attraverso l'azione e il reclutamento sul recettore di una proteina adattatrice, Sos. Questa essenzialmente attiva la G protein.
La proteina Sos non possiede domini SH2, viene reclutata al recettore attivo perché accoppiata a un adattatore, Grb2, proteina dotata di dominio SH2 che possiede anche un dominio SH3 che gli conferisce la capacità di legare la proteina Sos. Dopo l'attivazione di Ras c'è l'attivazione di Raf (un'altra chinasi) e una cascata di attivazione che porta alla proliferazione.
Riassunto step by step:
1. Il complesso Grb2/Sos (accoppiati via SH3) viene reclutato al recettore (tramite SH2 di Grb2)
2. Sos attiva Ras (GDP sostituito con GTP)
3. Ras recluta ed attiva Raf (chinasi)
4. Raf fosforila e attiva le MAPK/ERK
5. Fosforilazione di fattori di trascrizione (fos, jun, SRF)
6. Sintesi delle proteine necessarie alla fase S (cicline, CDK, DNA polimerasi)
Sos induce lo scambio GDP di una Ras inattiva con GTP e poi a seguire come descritto. La prima chinasi ad essere reclutata è Raf e poi le MAPchinasi che determineranno gli eventi molecolari.
Bersagli alternativi a valle dei recettori.
Esistono altre molecole che possono essere reclutate, al posto di Ras. Possono essere reclutati direttamente dal recettore o tramite il trasduttore altre proteine. PI3K (fosfatidil-inositol 3 chinasi) è una chinasi di fosfoinositili di membrana, genera molecole necessarie per attivare la via di AKT (serintreonin chinasi con importanti funzioni soprattutto di regolazione dell'apoptosi). Può essere reclutata, sempre sul recettore, la proteina STAT che vedremo meglio essere una proteina che una volta soggetta a fosforilazione forma dei dimeri, che possono essere omo o etero, i quali vengono trasportati all'interno del nucleo e poiché possiedono dei DNA binding domain sono in grado di interagire con il DNA e indurre la trascrizione genica.
Poi della fosfolipasi C avevamo già parlato: la tipologia gamma possiede un dominio SH2 fa sì che possa essere reclutato dal recettore e generare dei secondi messaggeri (tra cui la mobilitazione del calcio).
AKT.
Questa serin-treonin chinasi oggi uno dei target della terapia farmacologica soprattutto nell'ambito oncologico. Perché? Perché è in grado di bloccare i segnali apoptotici: se ho una cellula alla quale ho comunicato dei segnali di autodistruzione per una qualsiasi ragione e ho presenti dei fattori di crescita, la presenza di AKT blocca questi segnali cellulari. D'altra parte AKT è coinvolta anche nello stimolare il ciclo proliferativo in quanto interagisce con un regolatore, retinoblastoma, del passaggio da una fase e l'altra.
mTOR.
È una chinasi alla fine della cascata dei fattori di crescita. Ha importanti ripercussioni sulla sopravvivenza cellulare (segnali anti-apoptotici), ma soprattutto è coinvolta nella regolazione della traduzione degli mRNA, crescita cellulare intesa come crescita volumetrica e nella proliferazione. mTOR è importante perché è una via in cui convergono altri segnali trofici che possono arrivare sulla cellula: non solo i fattori di crescita ma anche segnali energetici (alti livelli di ATP) o i nutrienti presenti nell'ambiente (assorbimento di aa e di glucosio). L'attivazione di mTOR contribuisce a sostenere, a creare un circolo virtuoso che mantiene la vitalità cellulare. La sintesi proteica indotta da mTOR fa sì che in maniera selettiva o preferenziale vengano sintetizzate proteine coinvolte nel trasporto di nutrienti sulla membrana plasmatica. Sempre grazie alla sua attività sulla sintesi proteica vengono attivati dei fattori di trascrizione (HIF-1, un fattore indotto nelle condizioni di ipossia) che ha come programma finalistico quello di produrre fattori angiogenici: in primis la produzione di VEGR (vascular endothelial growth factor).
Abbiamo in cima un singolo evento: interazione di un ligando col suo recettore. A partire da questo abbiamo un ventaglio di opportunità (molte di queste si verificano contemporaneamente nella stessa cellula): Ras e via che porta alla duplicazione cellulare; via di AKT; via di mTOR.
Cross-talk recettoriale.
I recettori per fattori di crescita sono maggiormente esposti in aree specifiche della membrana plasmatica specializzate nel ricevere segnali dall'esterno. Si tratta di microdomini di membrana in cui c'è continuo scambio di segnali sia con l'esterno ma anche di segnali trasversali in membrana. I fattori di crescita fanno parte di un sistema complesso che nel cross-talk recettoriale stabilisce una serie di momenti funzionali della cellula, motivo per cui stimolo un recettore per fattore di crescita e posso vicariare la funzione di alcuni recettori accoppiati a proteine G e viceversa.
Riassumendo quel che abbiamo detto.
I recettori per fattori di crescita sono primi messaggeri diffusibili rilasciati nell'ambiente extra cellulare. Vanno a interagire con recettori di membrana caratterizzati dall'essere proteine a singolo attraversamento di membrana. L'interazione causa dimerizzazione e fosforilazione dei residui di tirosina. Piu' effettori possono essere reclutati a valle del recettore innescando una serie di segnali a cascata in cui la fanno da padroni le tirosin chinasi con possibilità di cross-talk con altre famiglie recettoriali. La complessità di questi segnali e le ripercussioni su quello che è il trofismo, il differenziamento, ecc, rende l'attenzione su queste vie di trasduzione un momento essenziale della ricerca di base soprattutto di quella applicata nel trattamento di diverse patologie. Esistono patologie da mancata attivazione dei fattori di crescita o dei relativi recettori e sono limitate ad alcune tipologie. Mentre per quanto riguarda il versante opposto, l'iperattivazione, attivazione incoordinata dei fattori di crescita, rappresenta un momento importante nella trasformazione neoplastica con diversi esempi che provengono dalla terapia di iperattivazione di chinasi.
Ecco alcuni esempi:
• proteina src
• recettore Her-2
• recettore c-Kit (recettore SCF mutato, tumori solidi, mielomi)
• Bcr/Abl (tirosin-chinasi citosolica, leucemie)