Trascrizione genica.
Lo step essenziale è il reclutamento dell'RNA polimerasi sul promotore. L'RNA polimerasi non si siede casualmente sul gene dove capita. La regolazione della trascrizione genica dipende dalle sequenze nucletodiche che precedono il primo esone che verrà a essere letto in cui è presente l'ATG (promotore). Nel promotore abbiamo un insieme di regulatory elements, alcuni più importanti di altri. Nelle vicinanze dell'ATG abbiamo il TATA-box o l'Initiator, essenziale per innescare il corretto assemblaggio del complesso proteico in cui è presente l'RNA polimerasi. Sul promotore sono presenti anche sequenze Enhancers per aumentare la frequenza degli eventi trascrizionali, reclutano proteine che rendono massima l'efficienza dell'RNA polimerasi.
Abbiamo anche sequenze Repressors che recluteranno proteine che si oppongono alla trascrizione, alcune di queste servono a reclutare le deacetilasi istoniche. La trascrizione è il risultato di un assemblaggio modulare di più proteine. L'RNA polimerasi viene posta in prossima del primo esone e procede la trascrizione con la produzione di un mRNA. La trascrizione dipende dall'assemblaggio di un complesso (complesso di pre inizio) il quale è uguale per tutti i geni di cui noi disponiamo, è costituito dalle stesse proteine e vale per tutti i geni. Il problema è capire come mai lo stesso gruppo di proteine valide in tutte le cellule, poi determinino la sintesi di mRNA diversi in fasi diverse della cellula. Dipende dal fatto che questo complesso è sì necessario per reclutare l'RNA polimerasi sul gene ma non è sufficiente. L'assemblaggio è intrinsecamente instabile, serviranno dei puntelli che stabilizzeranno il complesso e consentiranno alla polimerasi di interagire con il gene per tutto il tempo necessario.
I membri del complesso di pre inizio sono:
• In corrispondenza della TATA-box abbiamo l'assemblaggio di fattori di trascrizione, indicati con la sigla TFIID (perché portano l'RNA polimerasi II). Questo TFIID è costituita da una TATA-box binding protein che la scopo di riconoscere la sequenza segnale e da fattori associati a questa TATA-box binding protein. Queste hanno lo scopo di trovare il punto di inizio lettura.
• TFIIB. Fa da adattatore per un altro fattore (TFIIA)
• TFIIA. Essenziale per interagire con i fattori di trascrizione specifici che stabilizzeranno il complesso
• Il TFIIB recluta anche l'RNA polimerasi, porta questo complesso enzimatico nelle immediate vicinanze dell'inizio della trascrizione
• Su questo scuffle di proteine viene reclutato il TFIIF, catalizzatore dell'assemblaggio del complesso, conferisce una certa stabilità
• TFIIE apre la bocca catalitica dell'RNA polimerasi, predispone il complesso dell'RNA polimerasi a una corretta lettura del filamento che dovrà essere trascritto
• TFIIH porta con sé le funzioni girasica ed elicasica, determina un cambiamento conformazionale della doppia elica, fornisce un giro alla doppia elica, e fa in modo che si crei la cosiddetta bolla trascrizionale
Quando e quale gene verrà ad essere scritto dipende dagli eventi che si giocano sul TFIIA. Il PIC è necessario per la trascrizione di qualsiasi gene del nostro genoma. Più proteine attivatrici vengono reclutate sul promotore, più efficiente sarà la trascrizione. Un complesso instabile, collaborando con altri complessi presenti sul promotore, con funzione stabilizzatrice, andrà incontro a una corretta trascrizione. La formazione del complesso viene definito anche enansiosoma. Esempio del gene per l'IFN-b. Vengono a essere attivati dei fattori di trascrizione come NFkB, IRFs e altri che si vanno a sedere sul promotore del gene e stabilizzano il PIC (complesso di pre inizio) e reclutare delle istone acetiltransferasi. Le acetiltransferasi sono essenziali perché la trascrizione abbia luogo. Se l'RNA polimerasi trova di fronte a sé nucleosomi fortemente impaccati allora si staccherà e la trascrizione viene interrotta.
L'assemblaggio dell'enansiosoma serve a massimizzare l'efficienza della trascrizione e conferire specificità. Come vengono controllati questi attivatori della trascrizione? I fattori attivatori possono essere espressi in maniera tessuto-specifica, alcune cellule dispongono di questi fattori oppure no. Oppure la loro sintesi è inducibile per eventi extracellulare. L'attivazione può avvenire per eventi post-traduzionali. Questa proteina può essere presente nella cellula ma in un comparto inattivo, la cellula è in grado di governare la localizzazione e stabilire quando è il momento di attivare la trascrizione. Il segnale per l'attivazione della trascrizione è l'interazione con un ligando.
Fattori di trascrizione specifici:
• Attivati da ligandi (recettori intracellulari, es. steroidei)
• Attivati da signal trasduction (es. CREB, NfkB, NFAT, Jun, Fos)
• Attivati per neosintesi
I recettori intracellulari incontrano il ligando all'interno della cellula, o nel citoplasma o direttamente nel nucleo. Recettori per vit D, acido retinoico, hanno localizzano nucleare, recettori per steroidi sono intracellulari.
Quando arriva il ligando formano dei complessi, generalmente dei dimeri, che si siedono sul DNA e consentono l'assemblaggio e la stabilizzano del PIC. La famiglia dei recettori intracellulari ha delle caratteristiche funzionali comuni. Troviamo recettori diversi per ligandi diversi. La condizione funzionali di questi recettori è quella di agire come fattori di trascrizione. Devono riconoscere il DNA in maniera topologica. Sono dotati di un dominio di legame al DNA che di solito si trova al centro della sequenza amminoacidica. Esistono strutture a cerniere di leucina, a 4 dita di zinco, ad alfa elica, ecc. Poiché devono rispondere conseguentemente all'interazione con un ligando devono avere un dominio preposto all'interazione con questo, hormone binding domain. Questi recettori hanno tendenzialmente una elevata omologia tra di loro, ci sono solo regioni ristrette della sequenza significativamente diverse, altri domini sono abbastanza comuni e costanti. Ciò comporta una certa cross attività trascrizionale. È caratteristica tipica dei recettori intracellulari quella di avere effetto specifico per un determinato ligando, ma avere anche effetti sovrapposti con altri ormoni, questo dipende dal livello di segnale.
Se ho un recettore per i glucocorticoidi, a bassi dosaggi di cortisolo avrò netta prevalenza di effetti tipici dei glucocorticoidi. Se c'è tanto cortisolo nel sangue, il reclutamento massivo di questi recettori andrà ad attivare anche altri geni che abitualmente sono attivati dai mineralcorticoidi.
I recettori intracellulari passano per una struttura inattiva e quando arriva il ligando vengono spiazzate le proteine inibitorie e vengono reclutate proteine attivatrici. Queste proteine coattivatrici hanno la funzione di stabilizzare il complesso attivo del fattore di trascrizione e in alcuni casi (se il recettore è collocato nel citoplasma) consentire il passaggio del recettore da questo distretto al nucleo. Il recettore è formato da DBD ( DNA binding domain), AD (dominio di attivazione) e LBD (ligand binding domain); AD andrà a interagire con TFIIA. Dove si lega il DBD? Su sequenze (responsive elements) di nucleotidi che possono variare da 6 a 12 nucleotidi, strutturate in maniera particolare. La sequenze presenta un centro di simmetria, ai margini dei quali i nucleotidi si dispongono con una sequenza palindrome. Queste sequenze sono ripetute più volte nel complesso del promotore. Queste sequenze hanno una certa omologia anche per recettori di tipo diverso. Ci può essere una sovrapposizione negli effetti trascrizionali.
I Responsive elements per i recettori degli steroidi sono costituiti classicamente da sequenze palindrome ripetute più volte nel contesto del promotore. Elevata omologia anche tra recettori di diverso tipo. Parziale overlapping trascrizionale.
Altra modalità di attivazione è quella per via signaling, modifiche post-traduzionali che possono verificarsi. Abbiamo visto recettori accoppiati a proteine G che determinano l'attivazione di adenilato ciclasi che attiva protein chinasi A. La protein chinasi A attiva ha tra i suoi substrati un fattore di trascrizione, la proteina CREB. Questa abitualmente si trova già nel nucleo, addirittura ad interagire con il DNA, quello che le manca è la possibilità di interagire con il complesso di pre inizio. Il legame è garantito dalla fosforilazione della proteina CREB, quando la protein chinasi A o altre chinasi, la fosforilano su residui di serina, CREB sarà in grado di reclutare un adattatore (CBP) che si pone a ponte con il complesso di pre inizio.
Altro esempio: NfkB. Il complesso è dato da due proteine (p50 e un'altra proteina) si trova nella forma inattiva legata a un inibitore che può essere oggetto di fosforilazione, perde contatto con NfkB, IkB viene mandato a degradazione e il fattore di trascrizione può andare nel nucleo dove determina la sintesi di citochine proinfiammatorie e infiammatorie. Tra i geni trascritti da NfkB c'è anche lo stesso inibitore, il ciclo si chiude producendo inibitore e limitando l'azione di questo sistema. La conoscenza dei meccanismi connessi alla trascrizione e quindi di quello che sono i risultati sul differenziamento cellulare, proliferazione, vitalità, ha consentito di studiare strategie terapeutiche nel trattamento di tumori. Un target è quello delle modifiche epigenetiche, soprattutto per quanto riguarda la riorganizzazione della cromatina. La trasformazione neoplastica viene attuata da una cellula riequilibrando la spinta dei fattori mitogeni, proliferativi, antiapoptotici, rispetto all'azione di quelle proteine che si oppongono al ciclo cellulare e favoriscono l'apoptosi.
Nella cellula neoplastica ci sono più proteine che spingono verso la sopravvivenza rispetto a quelle che si oppongono. Questo tipo di riequilibrio dipende dal fatto che le cellule sono in grado di silenziare in maniera selettiva e specifica quei geni che si oppongono alla proliferazione e alla sopravvivenza. Una maniera per attuare il programma neoplastico è quello di bloccare la lettura di quei geni proapoptotici o antiproliferativi. Questo avviene agendo sull'acetilazione istonica, o sulla metilazione del DNA e degli istoni. Nella pratica clinica si è scoperto che sono frequenti le metilazioni associate alle forme tumorali. Le mutazioni epigenetiche sono alla base della trasformazione neoplastica e possono diventare un target utile ai fini terapeutici. L'equazione che si viene a creare è che nel cancro sono presenti alti livelli di deacetilasi e portano alla ipoacetilazione di geni connessi alla repressione del ciclo cellula e della risposta apoptotica. Una inibizione dell'azione di queste deacetilasi può riportare l'equilibrio verso una condizione fisiologica.
Oggi si trova già impiegato il VORINOSTAT ®, un farmaco derivato dal DMSO che è un potente inibitore delle deacetilasi istoniche. Qual è l'effetto del farmaco? Indurre il differenziamento, l'arresto della crescita e in alcuni casi anche l'apoptosi della cellula. Il tutto partendo da istoni acetilati. Questa iperacetilazione che è generalizzata determina una risposta apoptotica solo nelle cellule neoplastiche, perché solo queste hanno sfruttato il meccanismo dell'acetilazione per diventare cellule neoplastiche.
Il vorinostat viene impiegato o come radiosensibilizzante (in associazione con radioterapia) o come monoterapia nel trattamento di alcune forme leucemiche o in alcune forme di mieloma multiplo. Questi farmaci sono dotati di bassa tossicità proprio per questa selettività di azione.
Tossicità: trombocitopenia, vomito e diarrea, alterazioni ematochimiche e cardiache, non impiegato in gravidanza (effetti teratogeni). Questi effetti collaterali sono però sporadici e risolvibili anche non in strutture ospedaliere.