Necrosi.
Processo passivo, patologico, sempre.
Alterazione dei principali meccanismi metabolici (respirazione mitocondriale, produzione di ATP). Alterazione della permeabilità di membrana. La cellula esplode, non solo la membrana ma anche gli organelli dotati di membrana all'interno della cellula. Tra questi i più distruttivi sono i lisosomi perché contengono un pool di enzimi capaci di digerire tutte le componenti della cellula. Il risultato è che le celle sentinella dendritiche presenti nel tessuto in cui è in atto un fenomeno necrotico sentiranno queste modifiche come un innesco alla risposta flogistica. Il sistema immunitario instaurerà una classica risposta in cui vengono prodotte citochine infiammatorie con una reazione a catena. Ecco perché la necrosi è sempre un evento patologico.
Al contrario nell'apoptosi il processo è geneticamente determinato. Una parte della nostra informazione contenuta nel genoma è dedicata a proteine che attuano questo programma di suicidio.
La cellula non subisce degli eventi ma li attua. A seconda delle condizioni in cui si verifica può essere indotto autonomamente da una serie di segnali presenti all'interno dell'organismo oppure può essere indotto dalle situazioni di emergenza, di stress.
L'apoptosi non è definibile a priori come un evento cattivo o positivo, ma a seconda delle circostanze in cui si trova a verificarsi. Nella necrosi parte per primo il mitocondrio, smette di funzionare e non produce ATP. Nell'apoptosi invece il mitocondrio è attivo, va incontro a modificazioni ma nulla accade all'ATP e a quegli enzimi ATP-dipendenti. La permeabilità degli organelli dotati di membrana e della membrana plasmatica è conservata fino alle fasi finali dell'apoptosi. Se c'è una conservata semipermeabilità di membrana, non c'è riversamento di materiale cellulare nell'ambiente extracellulare, non c'è innesco di una risposta distruttiva della matrice extracellulare. Le cellule in apoptosi invece di rigonfiarsi incomincia ad implodere, si compatta, diventa più piccola a partire dal suo nucleo che si frammenta in piccoli vescicolati e anche il citoplasma andrà incontro a questo tipo di disgregazione in vescicole dotate di membrana contenente materiale di membrana. Questo è il fenomeno di blebbing di membrana.
Formazione di corpi apoptotici. Assenza di risposta flogistica e assenza di danno tessutale generalizzato. Se c'è un deficit dipende esclusivamente dal fatto che una cellula che svolgeva un determinato compito non lo svolgerà più. Questi corpi cellulari rilasciati nell'ambiente extracellulare potranno essere assorbiti dalle cellule vicine, soprattutto dai fagociti, e il loro materiale verrà riutilizzato e riciclato. È un processo estremamente conservativo e discreto di morte cellulare. L'apoptosi non è né buona né cattiva, ma un'apoptosi richiesta può essere utile. Per esempio la formazione delle estremità, in particolar modo mani e piedi. In una fase dello sviluppo embrionale le nostre estremità sono simili a delle pinne unite da pliche interdigitali di tessuto epidermico che dovranno andare incontro a un rimaneggiamento e riassorbimento. Questo meccanismo dipende strettamente dall'apoptosi.
Se per qualche motivo il programma apoptotico di queste pliche viene a essere interrotto il risultato è la mancata distruzione dei plichi interdigitali. Durante la vita embrionale c'è un rimaneggiamento anche morfologico in vari distretti, nell'apparato cardiovascolare in particolar modo. L'embrione non utilizza l'ossigeno derivato dalla respirazione ma quello assorbito attraverso la placenta. Il circuito vascolare polmonare serve solo a ossigenare i tessuti polmonari in divenire ma non a assimilare ossigeno dalla respirazione. C'è una sorta di shunt, gran parte del circolo vascolare prioritario è quello arterioso e venoso verso la periferia e verso i vasi ombelicali. Al momento in cui il sangue esce dal ventricolo per andare verso l'arteria polmonare incontra una scorciatoia che lo rimanda verso la circolazione periferica. Questa scorciatoia, questo shunt, si chiama dotto artero-venoso di Botallo.
La pervietà di questo dotto è essenziale per garantire una normale ossigenazione e favorire la circolazione placentare. Fin tanto che l'embrione si trova all'interno dell'utero deve essere pervio. Con i primi atti respiratori dopo la nascita i polmoni devono entrare in gioco e ossigenare il sangue. Questo shunt deve essere occluso. Nei giorni successivi questo dotto verrà definitivamente chiuso e rimarginato, diventerà una sorta di legamento fibroso che è il risultato dell'apoptosi di quelle cellule che costituivano il vaso. Se non c'è il meccanismo apoptotico abbiamo un quadro patologico, l'apoptosi è il fenomeno fisiologico. Ancora una volta l'apoptosi è buona.
Altro esempio di apoptosi buona. In tutte le patologie neoplastiche i due capisaldi sono duplicazione incontrollata e mancata morte cellulare. La risposta apoptotica è un salvacondotto della cellula per evitare la trasformazione. Quando qualcosa non funziona nel programma duplicativo viene innescata l'apoptosi. Se l'apoptosi viene bloccata la cellula prosegue nel proprio programma di trasformazione. Quadri apoptotici si associano a quelli necrotici in diverse patologie. Per esempio nelle ischemie vascolari. Il diminuito apporto di ossigeno creano uno stato di crisi metabolica. Lì dove la crisi è pressante la cellula non è più in grado di produrre APT e va incontro a necrosi. Ma tutto attorno al centro di necrosi avremo una grande fascia di cellule, più vicine ai vasi, in cui è ancora presente dell'ossigeno e dei nutrienti ma a un livello sub ottimale.
Queste cellule costituiscono la penombra ischemica, danzano su un filo, possono andare o verso la morte o possono essere recuperate alla vita. In quei quadri di ischemia è importante agire velocemente perché recuperando le cellule della penombra ischemica si limitano i danni. Queste cellule se vanno incontro a morte lo fanno per apoptosi. Un ampliamento dell'evento ischemico dipende dall'innesco di una apoptosi massiva. Così anche nelle malattie neurodegenerative. Raramente troviamo tessuti necrotici, nella maggior parte dei casi troviamo tessuti in cui c'è una degenerazione di carattere apoptocio, è quello che avviene nel Morbo di Alzheimer, nel Parkinson, nella sclerosi multipla e così via.
In questo caso i neuroni perdono vitalità, attivano il programma apoptotico, l'assenza di questi neuroni si configura con un quadro patologico. Esistono dei fenomeni di innesco, poi abbiamo la fase effettrice o di amplificazione del segnale in cui diverse molecole collaborano all'attuazione del programma per arrivare alla finale fase di degradazione. In ciascuna di queste fasi agiscono proteine diverse che vedremo fra poco.
Innesco.
Due sono le possibili vie che si contrappongono ma a volte collaborano nel far partire il programma apoptotico:
• Via estrinseca. Interazione ligando recettore (death receptor).
• Via intrinseca. L'innesco è dato da proteine intracellulari, citosoliche, le quali vengono sintetizzate per attivare il programma apoptotico.
Via estrinseca.
TNFR è il capostipite della famiglia dei recettore definiti death receptors. In questa famiglia troviamo CD95 (recettore del ligando Fas). Si presenta nella sua forma attiva come trimero (TNFR), un omotrimero transmembrana, in cui il dominio N-terminale è extracellulare e preposto ad interagire col ligando e con un dominio intracellulare che serve a reclutare degli adattatori, non c'è attività catalitica intrinseca. Esiste solo questo dominio C-terminale intracellulare necessario a reclutare degli adattatori nel momento in cui si forma il trimero. Il ligando esiste nella forma trimerica, è il ligando quindi a indurre la forma trimerica del recettore. Nel caso TNFa il ligando può trovarsi esposto sulla membrana di una cellula vicina, l'incontro con il trimero del ligando compone il trimero recettoriale attivo. L'altra possibilità è che il ligando venga rilasciato nell'ambiente extracellulare; delle metalloproteasi tagliano l'ultima parte del dominio extracellulare del ligando e consentono a questo di diffondere nella matrice extracellulare.
Esiste quindi una forma solubile del ligando e una forma di membrana, entrambe attive. Il trimero recettoriale allinea i death domain in maniera da formare un sito di docking per degli adattatori che vengono reclutati solo quando tre death domain sono allineati correttamente. Gli adattatori, spesso alternativi, sono FADD/Mort I, RIP e TRADD.
Queste proteine adattatrici reclutano proteine dotate di attività enzimatica. Queste proteine si chiamano Cysteine-dependent ASPartate-directed proteASE (CASPASE), proteasi dirette contro amminoacido aspartico, l'amminoacido catalitico della caspasi è una cisteina. Queste proteine vengono sintetizzate in forma inattiva e vengono attivate o per cambio conformazionale indotto (per esempio dagli adattatori reclutati sul recettore), oppure perché loro stesse sono oggetto di taglio proteolitico.
Questo ci suggerisce il concetto di cascata delle caspasi, in cui una caspasi attiva svolge la propria azione proteolitica su uno zimogeno di caspasi, lo taglia, lo attiva e così via a catena, a cascata. La forma attiva della caspasi, risultato di questo taglio proteolitico di attivazione, è costituita da due subunità catalitiche (quelle con la cisteina fondamentale per il taglio) e due subunità regolatorie che servono a favorire l'interazione tra la subunità catalitica e la proteina substrato. Queste subunità sono di più piccole dimensioni. In altri termini l'interazione tra ligando e recettore, la formazione del tirmero recettoriale recluta un adattatore, l'adattatore presenta death domain responsabili del reclutamento di caspasi inattive le quali una volta reclutate dall'adattatore e portate in stretta vicinanza fra di loro iniziano a esprimere la propria azione proteolitica. Si forma la caspasi 8 attiva, caspasi iniziatrice, la prima ad essere reclutata dal recettore. Inizi la serie di cascata che amplifica il segnale apoptotico.
Alcune caspasi sono strutturalmente adeguate a interagire con un recettore attivo e sono la caspasi 10 e la caspasi 8. Per questa loro caratteristica vengono definite caspasi iniziatrici o apicali. Dall'azione di queste caspasi iniziatrici dipenderà l'attivazione delle caspasi effettrici o esecutrici: le più ampiamente caratterizzate nella loro azione del programma apoptotico sono la caspasi 7, la caspasi 6 e la caspasi3. Dall'azione di queste dipenderanno al gran parte di rimaneggiamento a livello nucleare, di membrana plasmatica e la formazione dei corpi apoptotici.
C'è un altro gruppo di caspasi che non possono essere definite apicali perché non interagiscono con i recettori di membrana, ma possono essere le prime ad essere attivate quando questo parte da segnali intracellulari: caspasi 9 e caspasi 2. Sono capsasi che possono essere attivate a livello mitocondriale per prime: non interagiscono con i recettori. Funzionano nella via alternativa.
Oltre a queste caspasi ne esistono altri (14, 13 12 e 5) che non hanno alcun ruolo nell'attuazione del programma apoptotico, servono a produrre un taglio proteolitico sui precursori delle citochine, hanno un'importanza nell'attuazione del programma fluogistico ed immunitario.
Le citochine vengono prodotte come procitochine perché presentano delle sequenze segnale che determinano il fatto che vengano rilasciate nell'ambiente extracellulare. Prima che vengano rilasciate deve essere rimossa questa sequenza segnale e questa rimozione è operata proprio da queste caspasi. Nel caso delle caspasi il risultato finale è il suicido, quindi ogni qualvolta c'è un innesco improprio del programma la cellula deve avere un sistema per bloccarlo. Questi stessi meccanismi vengono usati dalle cellule per svincolarsi dai meccanismi di emergenza. Sono costituiti da proteine di piccole dimensioni che funzionano da falsi substrati, si offrono all'azione proteolitica delle caspasi ma non possono essere tagliati. Queste proteine rientrano nella famiglia delle IAP (Inhibitor of apoptotic proteins), sono diverse e non tutte funzionano alla stessa maniera.
IAP-1 e IAP-2 non si legano alla caspasi ma si legano al recettore impedendo che la caspasi apicale venga ad essere attivata. La proteina XIAP invece, cosi come MLIAP, interagisce direttametne fisicamente col complesso della proteasi, interagisce col dominio catalitico, blocca l'accesso al dominio proteolitico e i substrati non saranno oggetto dell'attività proteolitica.
A svincolarsi direttamente è la proteine Survivina, che inizialmente si pensava funzionasse come gli altri membri, poi si è scoperto che la survivina svolge la sua funzione nel check point di fase M. In pratica impedisce l'esecuzione del check point di fase M: le cellule che presentano cromosomi malarrangiati che andranno incontro a segregazione sbilanciata prosegue nel suo programma. Se over esprimiamo survivina, non ne blocchiamo la funzione, produrremo cellule aneoploidi o poliploidi. Survivina in effetti in molti tumori è sovra espressa.
Il TNF in realtà è una citochina controversa da un punto di vista degli effetti. È vero che esiste la via di induzione dell'apoptosi, ma il TNF in alcune tipologie cellulari ha una funzione protettiva contro l'apoptosi. Addirittura trofica. Perché? Perché il TNF può interagire con due classi di recettori. Se interagisce con TNFR1 induce la classica via di induzione delle caspasi alla quale può collaborare una via alternativa (vengono prodotte molecole lipidiche che attivano l'apoptosi mitocondriale). In alternativa se il recettore a essere coinvolto dal ligando e TNFR2 si determina l'attivazione di NFkB che ha funzione trofica e determina risposta antiapoptotica.
Via intrinseca.
Lavora di concerto all'altra via, possono sinergizzare e in alcune fasi convergono. Parte da segnali mitocondriali. La reazione di innesco dell'apoptosi si verifica a livello del mitocondrio. Il mitocondrio preserva la sua azione di fosforilazione ossidativa fino alla fine del programma, ma va incontro a modifiche che sono ragione dell'innesco dell'apoptosi. C'è una teoria evoluzionistica di questo aspetto del mitocondrio come boia della cellula. Si teorizza l'origine del mitocondrio come l'inclusione di un procariota all'interno di una cellula di più grosse dimensioni; una forma di simbiosi tra procariote e una cellula un po' più evoluta.
Questo organello che è ragione di vita in alcune circostanze può determinare il suicido cellulare. Queste circostanze sono per esempio danni al carico del DNA (alterazione della struttura, danni genotossici), stress ossidativo (produzione di radicali liberi), aumenti consistenti del Ca++ intracellulare, stress del reticolo endoplasmatico e infezioni virali.
Il mitocondrio va incontro a due modifiche transitorie, l'una collegata all'altra. C'è una transitoria perdita del potenziale di membrana del mitocondrio: nella membrana esterna ci sono cambiamenti che determinano una perdita del potenziale transitoria (pochi minuti). Questa perturbazione si manifesta anche con una transitoria aumentata permeabilità della membrana esterna il che determina il rilascio di fattori pro-apoptotici che determineranno l'innesco del programma esecutivo apoptotico e quindi i cambiamenti conformazionali prima descritti.
Sono nuovamente importanti le caspasi, vedremo. La fase di innesco dipende dalla diversa localizzazione di alcune proteine che interagiscono con la membrana esterna del mitocondrio e fanno parte della famiglia di Bcl2 (B cell lymphoma gene 2).
[Alla fine degli anni '80 un ricercatore italiano (Carlo Croce) inizia un programma di ricerca genetica con lo scopo di trovare, studiando il DNA e le sue mutazioni in diverse patologie, geni di rilevanza nella trasformazione neoplastica. Uno dei geni che caratterizza per primo è proprio questo che si forma in una forma alterata in una particolare forma di linfoma di cellule B: queste cellule producono una quantità massiva di questa proteine. Qualche anno dopo (anni '90) si scopre che questa proteina ha una funzione strutturale e serve a mantenere il normale potenziale di membrana del mitocondrio. Partendo dallo studio della proteina si cominciano a trovare una serie di proteine con motivi strutturali simili.]
Nella famiglia di Bcl-2 rientrano proteine con attività sia inibitoria dell'apoptosi (come Bcl-2) che proteine promotrici. Le ultime lavorano come antagonisti per le prime. Dell'equilibrio dell'espressione a livello mitocondriale tra induttori e inibitori dell'apoptosi abbiamo l'esito finale. Se prevalgono inibitori come Bcl-2 le cellule sono remissive rispetto ai segnali di apoptosi, viceversa se prevale l'espressione delle proteine promotrici l'apoptosi induciamo un programma di suicidio.
• Inibitori. Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-xs, AI, Boo, Mcl-1.
• Promotori. Bax, Bak, Bok, Bad, Bim/Bod, Bid, Noxa e Puma.
Il risultato finale dipende da chi prevale come livello di espressione. La formazione di dimeri, omodimeri o eterodimeri, per interazione proteina-proteina nel rapporto relativo tra i componenti di questi dimeri, determinerà il tipo di risposta che si verrà a creare. Diversificherà anche cellule normali da cellule potenzialmente neoplastiche. Gli inibitori dell'apoptosi sono proteine strutturali del mitocondrio (anche se presenti in altri organelli), residenti, e servono per preservare le normali condizioni di permeabilità e di potenziale di membrana.
Diversa è la situazione degli induttori dell'apoptosi. Questi devono trovarsi in un comparto inattivo e migrare nel mitocondrio solo quando serve attivare l'apoptosi. Qual è l'innesco di questi mediatori?
Ci sono meccanismi diversi. Per esempio Bad è importante per innescare l'apoptosi quando la cellula viene deprivata dello stimolo dato da fattori di crescita o da citochine. Fin tanto che la cellula è sostenuta nella sua attività trofica, Bad sta nel citoplasma perché è fosforilata, la fosforilazione le consente di essere reclutata da una proteina adattatrice che la tiene lontana dal mitocondrio. Quando rimuoviamo i fattori di crescita o le citochine agiscono fosfatasi attivanti che rimuovendo i gruppi fosforici liberano Bad che andrà nel mitocondrio antagonizzando l'azione di Bcl-2.
Altro meccanismo importante di attivazione, in molti caso è semplicemente l'aumentata sintesi di questi induttori che determina l'innesco, è quello della proteina Bim. In presenza di basse concentrazioni di calcio e di normale polimerizzazione dei microtubuli è legata al citoscheletro. Alterazioni dei livelli di calcio rimuovono la proteina da questo comparto di sequestro che andrà nel mitocondrio è innescherà l'apoptosi.
Altro meccanismo di attivazione (troviamo un incrocio tra la via caspasi dipendente e quella mitocnodriale) è il processamento di queste proteine induttrici da parte delle caspasi. Bid è prodotta in una forma più estesa e viene soggetta ad azione proteolitica da parte di caspasi 8. Si tagliano due frammenti, uno di piccole dimensioni e uno di circa 20 kDa che è in grado di interagire col mitocondrio e innescare l'apoptosi.
Cosa succede essenzialmente? Nel momento in cui arrivano gli induttori viene formato il permeability transition pore, poro di permeabilità transitoria. Questo comporta il rilascio di mediatori che attivano il programma di esecuzione dell'apoptosi e troviamo tra questi mediatori il citocromo C che è un elemento essenziale della catena di trasporto degli elettroni. Un enzima che abitualmente svolge una funzione cruciale per produrre ATP, vita per la cellula, nel momento in cui perde la sua localizzazione classica e va nel citosol, diventa un emissario del programma di morte. Molti degli effettori dell'apoptosi hanno questa doppia faccia. Nel momento in cui sopraggiungono stress abbiamo una perdita, un rilascio di proteine che abitualmente interagiscono con la membrana esterna del mitocondrio (in particolar modo citocromo C e Apaf-1 che interagisce con Bcl-2 in condizioni normali) e svolgono la stessa funzione che ha il death receptors per le caspasi apicali.
La caspasi 9 è la prima ad essere reclutata in questa via, perché reclutata da Apaf-1. Apaf-1 recluta citocromo C, ADP e caspasi 9, questo supercomplesso si chiama apoptosoma che serve per reclutare più procaspasi 9 e forzarli ad assumere la conformazione attiva. Da qui in poi il segnale, analogamente a quanto avvenuto per la caspasi 8, proseguirà attivando le caspasi effettrici. Le due vie a questo punto si congiungono e possono sinergizzare.
Il mitocondrio amplifica questo segnale proteggendo le caspasi dall'azione inibitoria delle IAP, rilascia delle proteine che facendo da buffer per le IAP, sequestrandole, consentono di perpetuare l'azione proteolitica delle caspasi attivate.
Smac/Diablo e Omi hanno questa funzione.
Come detto prima le due vie si incontrano down stream del mitocondrio perché convergono sull'azione delle caspasi effettrici (3, 6 e 7), ma si possono incrociare anche prima dell'innesco del mitocondrio. Nel caso del TNF o del ligando FAS l'azione dell'innesco dell'azione recettoriale, determinando l'attivazione della caspasi 8, ha come bersaglio intermedio la proteina Bid che tagliata dalla procaspasi migrerà nel mitocondrio e attiverà il programma apoptotico mitocondriale. In conclusione ritorniamo al famoso check point di fase S in cui c'è un incrocio tra la proteina del retinoblastoma e p53.
Danni al DNA attivando la via di p53 impedivano il passaggio di G1 a S poiché era inibita l'azione dei complessi ciclina/cdk. Senza produrre DNA polimerasi, ciclina a e cdk2 non si può andare in fase S. p53 che attiva anche gli enzimi preposti alla riparazione del danno, se il danno non viene riparato viene prodotto in grandi quantità, la sua proteina viene stabilizzata. Questo determina la trascrizione di geni caratterizzati da un promotore con una bassa affinità per p53. Ma se il danno genotossico è tanto, c'è tanta p53 attiva, anche questi promotori verranno occupati da p53 e il gene verrà trascritto e poi prodotto.
Tra queste proteine abbiamo Bim, Puma, Noxa, Bax. Tutte queste sono induttrici del programma apoptotico mitocondriale.
Il significato è che fin tanto che si può riparare p53 crea una sospensione del programma di duplicazione e innesco della riparazione. Quando il danno è troppo bisogna indurne il suicido e viene indotto dall'azione di attivatori della via mitocondriale. Tutto questo è alla base della gran parte della terapia farmacologica antineoplastica. Le molecole funzionano fin tanto che la via di p53 è sana.
Quando questa via è alterata questi farmaci non solo non inducono risposta terapeutica ma al contrario, essendo la loro ragione di partenza quello di distruggere il DNA, creare un danno per poi innescare la risposta apoptotica, se manca l'ultimo aspetto della loro azione quello che rimane è un danno a carico del DNA che rimane fissato nel genoma e la cellula neoplastica probabilmente diventerà ancora più maligna.