Farmaci biotecnologici: le proteine terapeutiche
Es insulina umana ricombinante
Dal 1982 al 2007 si è passata da una a più di 100 proteine terapeutiche.
Sono F approvati per l’uso clinico, interessante è che le 1200 small molecul approvate avevano la possibilità di aggredire circa 250 target molecolari (R, enzimi, DNA, proteine).
Per i f biotecnologici invece non si sovrappongono come target alle small molecol ma come target hanno molecole non toccate dalle small molecul (166 F biotec toccano 76 target, diversi dai 250 precedenti tranne 9).
Hanno ampliato il numero e la diversità dei target recettoriali toccati a scopo terapeutico.
Crescita esponenziale di questi F, in ogni anno la % di F nuovi approvati dalle angenzia regolatorie corrisponde per un quarto/un terzo a F biotecnologici.
Classificazione delle proteine terapeutiche:
1)terapia sostitutiva: avevano il compito di fare una terapia sostitutiva, rimpiazzando l’assenza o il defici della proteina target (es insulina –diabete –, ormone della crescita –nanismo-, eritropoietina (ormone che fa produrre gli eritrociti) –anemia da insufficienza remale cronica –, fattore VIII –emofilia (malattia su base genetica in cui il problema è fare coagulazione) di tipo A–).
Ci sono anche malattie genetiche in cui il problema non sono i fattori della coagulazione ma nel difetto nel produrre l’antitrombina 3. Si può fare terapia sostitutiva anche per questa proteina.
In malattie metaboliche in cui manca l’enzima chiave per fare metabolismo, sia di tipo lipidico che di altri tipi, sono malattie che danno disturbi cognitivi importanti e causano morte precoce.
Nell’era pre-biotecologica queste proteine erano ottenute per via estrattiva (processo lungo e costoso), inoltre molte proteine sono specie-sopecifiche (quindi la proteine per l’omo la posso prendere solo da cadaveri) e questo poteva portare a infezioni o contaminanti presi dalle proteine estratte.
I F biotecnologici hanno comunque costi elevati, che aumenta a swconda della copmplessità della proteina e del sistema ricombinante in cui si produce la proteina. Se la prot non è fosforilata e glicosilata si usa E.coli.
Se è glicosilata non posso farla produrre dai batteri: talora lieviti ma più spesso sistemi di espressione di mammifero (terreni di coltura con costi elevatissimi).
Es cellule CHO (cellule dell’epitelio ovarico del criceto cinese).
Modi diversi di produrle per evitare i costi elevati: fare produrre queste proteine non da cellule ma da organismi completi, per es i maiali transgenici che codificano per la produzione di una proteina terapeutica umana secreta nel latte del maiale.
Es la proteina era la proteina C umana ricombiante, si otteneva fino ad 1 g di proteina in 1 L di latte.
Stessa cosa per antitrombina 3.
Gli animali clonati in medicina non servono, mentre animali transgenici e poi clonati si (es Polly).
2) proteine che potenziano l’attività biologica già presente: da una prima fase in cui le proteine terapeutiche venivano usate per sopperire la macanza della proteina si è passati ad una seconda fase in cui si producono proteine terapeutiche.
Es in persone con problemi di fertilità, sono persone in cui non ci sono pochi ormoni FH, ma serve stimolare il sistema.
Es TPA (attivatore tissutale plasminogeno), non si ha perche non ce ne sia di endogeno ma per velocizzare la dissoluzione del trombo, potenzia un processo che nell’organismo è gia presente. Usato nell’ictus e nell’infarto.
Es DNA-asi: alla base della terapia per la fibrosi cistica
Es: G-CSF (granulocite colony stimulating factor): usato nei tumori, ha ridotto a neutropenie dovte all’esposizione dei chemioterapici.
Si usano queste proteine perché portandole dove servono ne potenzio la loro attività biologica ma che già è in funzione nell’organismo.
3) Proteine terapeutiche usate a scopo diverso da quello convenzionale: A volte invece è impo produrre le proteine e poterle usare per delle loro attività biologiche ingnote fino a quel momento, per es interferone alfa nella sclerosi multipla.
Non tutte le proteine terapeutiche devono essere proteine umane (es Exenatide)
Es F contro la trombosi: proteine della sanguisuga
4) vaccini proteici: vaccino per il papilloma virus, per epatite B
Fino a qui sono proteine terapeutiche di prima generazione, oggi siamo alla terza
Il bisogno di andare avanti con le generazioni è nato dal fatto che quelle di prima generazione avevano dei limiti.
-erano tutti agonisti: se il problema è che la proteina terapeutica funziona in eccesso non ho l’antagonista (es macromegania)
-sono proteine che richiedono somministrazione parenterale
-limiti nella durata d’azione: c’è sempre un sistema enzimatico o R che capta la proteina dal torrente circolatorio e la degrada
-hanno tutte il problema della immunogenicità (risposta del sistema immunitario), anche quelle tal quali. (es insulina del maiale, nel tempo perde di efficacia perché l’organismo produce anticorpi contro questa insulina)
-costo
-stabilità, formulazione e conservazione
Tutti questi aspetti potevano essere migliorabili, sptt farmacocinetica (durata d’azione), efficacia, diminuzione costo, avere meno effetti collaterali.
Comparazione degli aspetti dei F biotecnologici (incluse prot terapeutiche) e small molecul:
SMALL MOLECUL:
-chi li disegna si immagina di darlo per la via piu economica e semplice: la via orale
-il F arriva nella circolazione sistemica attraverso i capillari sanguigni
-distribuzione ai tessuti è dipendente dal rate di perfusione, liposolubilità, legame alle prot plasmatiche, ecc.. e la distribuzione è prevedibile
- metabolismo di fase 1 e 2, per far diventare la molecola più idrofila (eliminazione per urine), posso anche formare metaboliti attivi
-tossicità selettiva, perché magari in un altro tessuto c’è uno stesso R ma succede un’altra cosa oppuresi legano a R diversi, ma comunque è regolata
-raramente determinano una risposta immunitaria (può esserci ipersensibilità ma non vera risposta antigenica)
F BIOTECNOLOGICI:
-non per via orale,
-devo darlo direttamente endovena altrimenti ho problemi di assorbimento, è difficile passare attraverso i vasi, di solito si usa la circolazione linfatica
-distribuzione non prevedibile, la proteina è grossa e magari ha modificazioni
-non c’è metabolismo di farse 1 e 2, è un metabolismo catabolico con enzimi come peptidasi e proteasi (formo aa, perdo l’attività biologica)
-tossicità imprevedibile e complicata
-spesso sono antigenici, riconosciuti come not self dal sistema immunitario
Immunogenicità:
ci sono risp immunitarie alle prot terapeutiche che pur essendo dimostrabile la formazione di anticorpi anti-anticorpo monoclonale non ci sono conseguenze gravi, in altri casi invece le conseguenze e gli effetti avversi sono tali da causare la morte dell’individuo.
Il compito delle aziende farmaceutiche è cercare di capire informazioni sui rischi di quella proteina.
I casi in cui compare immunogenicità sono dovuti a:
-una risposta non completamente chiarita
-la risposta è completamente imprevedibile
Come faccio a capire il rischio? Guardo che anticorpi si sono creati in chi ha preso la proteina terapeutica:
-binding antibodies: si formano anticorpi che legano il F, le conseguenze cliniche non sono impo perché non interferiscono con l’attività terapeutica della proteina e non causano tossicità
-sustaining antibodies: legano il F e fanno si che nell’organismo ci sia prot libera e altra legata, questa legata però sa ancora svolgere l atività bilogica, accumulano la proteina e rallentano il catabolismo, non ci osno gravi conseguenze
-clearing antibodies: non accumulano la prot ma ne accelerano la scomparsa dall’organismo
-neutralizing antibodies: sono preoccupanti, si legano al F e interferiscono con la sua attività biologica, per es impedendo che leghi il prorio R, riduco l’efficacia in modo marcato
-cross-reactive antibodieas: preoccupanti, reagiscono meglio la proteina endogena, non solo non ho l’effetto del F ma perdo anche lattività biologica della proteina endogena, ovvianete riconoscono anche la proteina terapeutica ela inattivano.
Il sistema si allerta perchè riconosce la proteina come estranea
Sappiamo quali F che piu spesso producono i neutralizing antibodies:
-insuline animali
-insuline ricombinanti analoghi variati di quella umana
-(in generale le proteine terapeutiche)
Perdo l’efficacia del F e neutralizzo la proteina endogena.
Fattori che influenzano l’immunogenicità di un F sono tanti:
-struttura della proteina
-contaminanti: oggi la tecnologia avanzata, ci sono tecniche chimico-analitiche che li fanno rintracciare facilmente quindi ce ne sono sempre meno
-formulazione della proteina: diverse formulazioni per una stessa proteina possono avere esisti diversi, incluse reazioni fatali
-via di somministrazione: non tutte sono ugualmente immunogene. La via endovenosa è meno immunogena della intramuscolare (cambia come l’antigene viene presentato).
-dose: è più immunogena una dose bassa che una alta (per meccanismi di tolleranza)
-durata (memoria immunologica)
-profilo genetico del paziente
Anche alcune malattie associate possono esporre all’immunogenicità, sono piu esposti anche quelli che contemporaneamente stanno facendo altre terapie.
Caso in cui l’immunogenicità ha causato danni e insegnato qualcosa:
eritropoietina (ormone prodotto da cell del rene, sono cell interstiziali che la producono in risposta all’ipossia locale).
Chi ha un’insufficienza renale grave non sono più capaci di produrla, vanno incontro ad anemia grave che espone al rischio di morte e della condizione basale della malattia.
Dopo pochi anni dal clonaggio del gene dell’EPO è stata fatta la proteina ricombinante.
È uscita una tossicità rara: PRCA (aplasia a cellule rosse di tipo 1), totale eliminazione delle cellule della linea rossa, in questi individui si formano anticorpi anti-eritropoietina che cross linkavano anche la poca eritropoietina endogena (oltre a quella somministrata).
Per anni ci sono stati solo 3 casi nel mondo di questa condizione, ci fu poi un aumento drammatico di PRCA a chi assumeva EPO ricombinante, alcuni casi fatali.
Si sapeva che EPO può essere alfa, beta, darbepoietina.
Dopo le prime EPO prodotte c’è stato un cambiamento di formulazione (Eprex), l’anno coincide con l’anno di aumento esponenziale di PRCA. Studi hanno dimostrato che il 95 % dei pazienti che hanno sviluppato PRCA aveva preso questa EPO (Eprex), si è immaginato che avesse a che fare con i cambiamenti di formulazione (venduto sia con che senza albumina). Le formulazioni precedenti avevano tutti l’albumina.
Sono state formulate spiegazioni sul caso dell’Eprex: è stato dimostrato che non c’era nessuna correlazione tra le caratteristiche del paziente e la PRCA, la via di somministrazione era sempre la intravenosa quindi non era la causa, esclusi problemi di conservazione.
L’attenzione si è spostata sulla formulazione del F, modificato nel contenuto di albumina umana.
Ma è uscito anche che, facendo analisi dei picchi in termini di contenuto di sostanze nei vari lotti di Eprex, non era solo la formulazione ma il modo in cui la siringa era stata prodotta. EPO era venduta già in siringa (preriempita), poteva fare la differenza il fatto che lo stopper (parte finale dello stantuffo) fosse rivestito o meno. Se lo stopper era rivestito non avevo problemi, se non lo era avevo i casi di PRCA.
Farmaci biotecnologici: evoluzione e innovazione:
Biobetters: F biotecnologici “migliori”, sono di generazione successiva alla prima. Questa denominazione è recente.
Vantaggi in termini di efficacia, ridurre rischio di immunogenicità, riduzione del numero delle somministrazioni giornaliere.
Dal 96 in poi: modifiche struuturali della proteina stessa.
Queste nuove proteine terapeutiche corrispondono a diverse tipologue di modificazione
-versioni in cui la proteina ha sostituzioni aminoacidiche: obiettivo di ridurre le allergie e minore rischio di ipoglicemia (nel caso dell’insulina LYSPRO e ASPART)
-proteine in cui si elimina una parte non utile o svantaggiosa dal pto di vista farmacocinetico: per es tagli proteolitici della proteina TPA (F trombolitici)
-chimere (prodotto di fusione tra molecole biologiche diverse)
-frutto di glicoingegnerizzazione: la glicosilazione enzimatica è importante, garantisce corretto folding, che in certe parti della prot essa sia estesa o in altre raggomitolata, fa avere tante cariche negative e la proteina glicosilata riconosce con affinità elevata il proprio R e svolgere la propria attività biologica. Avere la glicosilazione puo servire anche a mascherare siti antigenici o siti degradativi (es. TPA nella forma ingegnerizzata: tenecteplase, migliora selettività per substrato, si allunga l’emivita)
Eritropoietina: molecola piccola, subisce glicosilazione (3 su N e 1 su O)
Uso principale: prevenire l’anemia che si accompagna all’ insufficienza renale cronica
EPO batterica non glicosilata, rispetto alla nativa glicosilata, ha:
-PM piu basso
-ridotta solubilità
-si favorisce l’aggregazione
-scarsa stabilità
Così si capisce l’importanza della glicosilazione ma anche la non glicosilata continua ad avere buona affinità per il recettore in vitro, in vivo invece risulta molto meno efficace. La sua clearence renale è molto elevata (perché è più piccola).
Il bimbette dell’EPO è la Darbepoietina: sono conservati alcuni dei siti di glicosilazionem ne sono stati aggiunti due in posizione che in natura non si glicosilano, sono stati aumentati i iresidui di acido sialico.
In questa nuova proteina ho PM maggiore, maggiore contenuto in carboidrati, aumenta l’acido sialico e diminuisce il putno isoelettrico: F con efficacia e farmacocinetica molto migliorata!
-triplica l’emivita
-perdo un filo di affinità ma miglioro l’attività biologica
-piu stabile nel confezionamento
EPO ricombinante umana andava presa tre volte a settimana per migliorare la qualità della vita dei pazienti, con la forma mutata e glicosilata (Aranesp ®: darbopoietina) devono prenderlo una sola volta alla settimana
Altra calsse di F per cui esistono i biobetters: interferoni
Funzioni:
-antivirali
-inibitori della crescita
-immunomodulatori
IFN alfa 2 si usa nel trattamento dell’epatite B e C, sarcoma di Caposi. Si usa in ionoterapia (rapida Cl e emivita plasmatica, perché è un F piccolo).
È stato frutto di modificazioni pesanti, alcune strategie riguardano la PEGylazione e una di glicoingegnerizzazione.
Sono state fatte forme diverse di IFN, fino a definire quale IFN glicosilato fosse migliore dal putno di vista farmacocinetico rispetto a quello naturale.
C’è un IFN biobetter con 4 glicosilazioni in posizioni strategiche che ha emivita maggiore (di 25 volte per via sc e 12 per ev) e minore Clearance (20 volte per sc e 10 volte per ev).
-PEGylazione: si possono pegyilare proteine, small molecul e anticorpi.
Puo esser fatta in forma lineare o ramificata
PEG: idrofilico, neutro e non tossico.
PEGilare vuol dire aumentare dimensioni e PM, aumentare l’idorfilia e quindi la solubilità, mascherare una certa parte della proteina che potrebbe essere antigenica (rendo meno immunogenica la proteina), oppure mascherare siti di attacco proteolitico da parte di enzimi (aumento l’emivita di una proteina).
Le catene di PEG potrebbero essere un ostacolo sterico per l’interazione tra la prot e il suo R.
I benefici farmacocinetico sovrastano le limitazioni farmacodinamiche(riduzione dell’affinità per il R)? La sfrutt o se sono superiori i benefici.
Esempi di F PEGylati:
-Adagen: adenosina deaminasi, forma PEGylata dell’enzima è un F
-Interferoni pegylati (alfa 2 b e a): cura per epatite C
-Asparaginasi:
-GCSF
Differiscono per i tipo di PEGylaizone: lineare o ramificata.
1) La PEGylazione non è stata decisa a priori fino a poco tempo fa, ma si PeGylava random e poi si testavano tutti i vari campioni.
Esistono PEG di vario PM, a cui corrisponde una certa dimensione molecolare.
2) Oppure la PEGylazione puo essere selettiva verso un sito. Si sono sviluppate tecniche analitiche per capire quali forme di PEG sono presenti nella mistura
Es GCSF, usato in pazienti con neutropenia causata da trattamenti chemioterapici aggressivi, che uccidono i globuli bianchi, prodotti nel midollo osseo. I primi globuli bianchi a essere uccisi sono igranulociti neutrofili, perché sono quelli a emivita più breve. Si fa un iniezione con GCSF che stimola i precursori presenti nel midollo per fargli produrre neutrofili). GCSF è usato anche in chui subisce trapianto di midollo osseo, dandolo stimolo la produzione di granulociti al paziente nel momento in cui è più a rischio di infezioni.
GCSF umano ricombiante:
-forma ricombinante (filgastrim)
-forma glicosilata
-forma PEGylata della forma non glicosilata (PEGfilgastrim), con questa forma posso fare una iniezione per ciclo di chemioterapia e non iniezioni tutti i giorni come con Filgastrim. La forma PEGilata assicura ridotta clearence e uana minore fluttuazioni nelle concentrazioni plasmatiche, che risultano anche piu stabili el tempo
Piu facilmente si PEGylano le lisine e le cisteine, altre volte si PEGylano gli aa N-terminali. Si usano gruppi reattivi diversi!
I F PEGylati non sono forme pure! Sono misture di forme diversamente PEGylate.
La PEGylaizone in alcuni casi può ridurre l’immunogenicità di proteine terapeutiche che avevano questo poblema.
Interferoni alfa:
Epatite C: è la principale causa di malattie gravi epatiche, è poco diagnosticata e molto subdola, non da segnali di se, nel tempo chi ce l’ha può diagnosticare la cirrosi o un carcinoma epatocellulare (% minore).
È il principale motivo per un trapianto di fegato.
IFN 2 alfa ha potente attività antivirale, anche contro il virus dell’epatite C. Spesso IFN è dato in associaizone con degli antivirali.
Per molto tempo si è assunto IFN umano ricombianante: bassa solubilità e stabilità, emivita breve, non dato per os. Le somministrazioni sc si faceva un giorno di e uno no (3 volte a settimana).
Non si da tutti i giorni perché IFN alfa 2 ha tantissimi effetti collaterali:
-flu-like symptoms
-mal di testa, nausea, vomito diarrea,
-depressione maggiore, ansia, irritabilità
-caduta dei capelli, reazioni nel sito di iniezione
Le dosi sono voluminose e la ionoterapia spesso non è sufficiente.
Poi sono arrivanti gli IFN ricombinanti umani modificati con PEG:
-Pegasis: PEG IFN alfa 2 a:ha consentito di poter assumenre IFN una volta a settimana e IFN raggiunge rapidamente una concentrazione plasmatica, che si mantiene per tutta la settimana abbastanza costante. Somministrazione di dosaggi piu bassi. Volume di distribuzione: 8L
Ha attività che è solo il 7% della normale attività biologica. C’è una mistura eterogenea di moleocle monopegylate, il 94% delle moleocle è PEG sulla lisina 31. Eliminazione in 40 ore.
-PEGintron: PEG IFN alfa 2 b: attività biologica rispetto alla forma nativa del 28%. L’eterogeità è maggiore, ci sono 14 forme diverse di proteine PEG di cui la metà è PEgilata su una istidina. Volume di distribuzione 20L. velocità di assorbimento piu rapida di Pegasis e ha eliminazione in 80 ore.
Hanno usato una pegylazione random, una lineare e l’altra ramificata, hanno usato due miscele diverse.
Tutte queste caratteristiche influenzano i dosaggi, che rispondono alle differenze farmacocinetiche.
Misurando le copie di virus presenti in circolo:
Pazienti con IFN tal quale solo 28% hanno viremia sotto controllo, pazienti con forma PEG quasi 70% ha viremia assente.
Effetti collaterali meno devastanti: chi ha completato lo studio con IFN tal quale è il 60%, con la forma PEG l’80%.
PEGilando modifico la farmacocinetica (in meglio) e la farmacodinamica (in peggio).
Problema: tutte le molecole erano agonisti. Ma possono esserci patologie in cui serve un antagonista.
L’antagonista che è stato fatto è PEGylato, quindi miglioro le caratteristiche farmacocinetiche (aumentando le dimensioni diminuisco la clearance e allungo l’emivita, riduco l’immunogenicità e l’attacco proteolitico mascherando dei siti, …) il problema però è che aggiungere PEG potrebbe portare ad interferenze con il sito recettoriale e modificarne la potenza.
Pegvisomant:
acromegalia, malattia caratterizzata da deformazioni sptt di viso, mani e piedi. C’è un eccesso di crescita dell’osso in queste zone. Non sono solo problemi estetici ma è una malattia debilitante.
Cause: c’è un eccesso di funzionamento dell’ormone della crescita (GH) e anche si secrezione di questo ormone.
GH è un ormone proteico, il R è noto e si sa cosa succede a valle e quali segnali intracell si attivano (via JAK/STAT e chinasi).
GH è capace di interagire con il R in due siti di legame, uno ad alta affinità (binding site 1) e uno a bassa affinità (binding site 2).
Nell’acromegalia questa via del segnale è iperfunzionale, ci vorrebbe un antagonista per inibire questa via. L’antagonista deve occupare il sito, spazzare l’agonista endogeno e spiazzarlo non dando il via al segnale.
Pegvisomant fa proprio questo: occupa gli stessi siti di GH impedendo che però a valle avvenga il segnale.
Il F è stato disegnato per interagire opportunamente con i due siti di legame ed è stato PEGilato.
L’antagonista inizialmente sviluppato (prototipo) ha una diversa struttura aminoacidica rispetto all’agonista endogeno: sostituzione in posizione 120, rilevante per l’interazione con il sito di legame 2. Questo prototipo di F (G120K-GH) lega il sito recettoriale, lo occupa senza causare attività a valle. Continua ad avere una buona affinità per il R (si lega bene). Ma ha un’emivita molto breve per fare un F.
Si è PEGilato il G120K-GH questa ha assicurato un aumento della farmacocienetica (emivita sierica è aumentata di quasi 400 volte), il problema è che si è ridotta l’affinità, quindi dovrei dare troppo F.
Sono stati fatti altri cambiamenti, si è arrivati al B2036, che conserva l0antagonistmo ma migliora l’affinità, sono state inserite sei mutazioni nella regione ad alta affinità. Modificando questa regione della proteina l’affinità per R è di nuovo migliorata, poi si è PEGilata questa forma modificata e si è ottenuto un F che ha una buona emivita sierica e anche una buona affinità.
B2036 è il F in commercio, cioè Pegvisomant: antagonista competitivo per ormone GH usato per l’acromegalia. Si puo fare una somministrazione al giorno, per via parenterale (sottocutanea perché è una proteina).
IGF-1 (insulin Growth factor 1): pazienti che assumono Pegvisomant riducpono l’attività di questo fattore che è responsabile anch’esso della malattia e delle sue complicanze.